【摘要】  目的 了解急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠液体复苏时给予外源性清蛋白对C反应蛋白(CRP)、前降钙素(PCT)以及肺湿质量、干质量的影响.方法 将108只昆明小鼠随机分为两组,正常对照组12例,腹腔注射15 mg/kg生理盐水;致伤组96例,腹腔注射内毒素(LPS)15 mg/kg,制备ARDS模型.致伤组分为未治疗组和治疗组,治疗组又分为低浓度清蛋白组(尾静脉注射0.5 g/L人血清清蛋白10 μL/g体质量)、高浓度清蛋白组(尾静脉注射50.0 g/L人血清清蛋白10 μL/g体质量)、羟乙基淀粉组(尾静脉注射60.0 g/L羟乙基淀粉10 μL/g体质量).正常对照组于注射后4 h断颈取血,致伤后各组分别于注射后4、8、16、24 h断颈取血(每次6只小鼠),用ELASA法测定血清CRP和PCT;同时留取肺测湿质量、干质量.结果 PCT在注射后24 h内随时间延长而升高,差异有显著性(H=17.97~21.60,q=4.08~6.88,P<0.01).与未治疗组比较,各治疗组PCT 8、16、24 h均下降(H=26.43~27.44,q=4.08~6.27,P<0.01).高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组差异无显著性(P>0.05).与未治疗组比较,低浓度清蛋白组CRP下降(t=23.37、28.32,H=15.16、19.55, q=4.08、4.58,P<0.01);高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组CRP 24 h无明显差异(P>0.05).致伤组小鼠肺湿、干质量比值4 h上升,8 h达到高峰,16 h有所下降,24 h稍有恢复,与正常对照组比较,差异有显著意义(H=23.15~24.70,q=4.28~6.87,P<0.01).结论 输入50.0 g/L人血清清蛋白能降低早期ARDS肺含水量,降低CRP和PCT,减轻炎症反应,有助于早期ARDS的治疗.
　　【关键词】  血清白蛋白;呼吸窘迫综合征,成人;C反应蛋白;前降钙素
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of exogenous albumin on C-reactive protein(CRP) and procalcitonin (PCT) and the lung wet /dry (W/D) weight in mice with acute respiratory distress syndrome (ARDS). Methods This study consisted of 108 Kunming mice, which were randomized to two groups: normal control, 12 mice, 15 mg/kg of normal saline and vulnerated groups(96 mice, 15 mg/kg of Endotoxin (LPS) to prepare ARDS models, both normal saline and LPS were in injected peritoneally. Treatment groups were divided into low-concentration-albumin (LCA) group (0.5 g/L of human serum albumin10 μL/g body mass), high-concentration-albumin (HCA) group (50.0 g/L of human serum albumin 10 μL/g body mass), and hydroxyethyl-starch (HS) group (60.0 g/L hydroxyethyl starch 10 μL/g body mass), the medicines were given through vena caudalis in the three groups. Blood samples were collected at 4 h after injection by breaking the neck in normal control, and at after4 h, 8 h, 16 h,and 24 h in  vulnerated group (six mice per each time). Serum CRP and PCT were determined by ELASA, and lungs were detected for wet /dry weight. [ Results[ PCT increased with the extension of the time within 24 h, the differences were significant (H=17.97-21.60,q=4.08-6.88,P<0.01). Compared with the untreated group, that of treated groups decreased at8 h, 16 h, and 24 h (H=26.43-27.44,q=4.08-6.27,P<0.01). No difference was found between HCA group and HS group (P>0.05). Compared with the untreated group, the PCT in LCA group declined (t=23.37,28.32;H=15.16,19.55;q=4.08, 4.58;P<0.01);  the difference of CPR between HCA group and HS group at 24 h was not significant (P>0.05) W/D of the lungs in vulnerated group reached the top at 8 h and somewhat lowered at 16 h then recovered slightly at 24 h, the difference was significant as compared with the control (H=23.15-24.70,q=4.28-6.87,P<0.01).   Conclusion 50.0 g/L albumin can reduce lung wet /dry weight in early stage of ARDS, lower CRP and PCT, relieve inflammation and conduce to early treatment of ARDS.
　　[KEY WORDS]Serum albumin; Respiratory distress syndrome, adult; C-reactive protein; Procalcitonin
　　急性肺损伤(ALI)是一种多病因导致的综合征,有可能发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS).ARDS 早期的特征性表现为肺毛细血管内皮细胞与肺泡上皮细胞屏障的通透性增高,肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液,其中富含蛋白及以中性粒细胞为主的多种炎症细胞[1].肺水肿程度与ARDS 的预后呈正相关,因此,积极的液体管理具有重要意义,围绕是否用清蛋白治疗的讨论始终是热点问题.ARDS是全身炎症反应综合征在肺部的表现,是一个多种炎症细胞和炎症递质参与的过程.评价炎症治疗过程的指标有很多,C反应蛋白(CRP) 是非特异性参数,前降钙素(PCT)则是一个具有高灵敏、高特异性的感染新指标.本研究采用腹腔注射内毒素(LPS)方法建立ARDS小鼠模型,探讨不同浓度外源性清蛋白输入对ARDS小鼠肺组织湿质量、干质量和CRP、PCT的影响,为临床应用人血清清蛋白治疗严重肺损伤提供实验依据.
　　1  对象和方法
　　1.1  实验动物及分组
　　健康昆明小白鼠,清洁级,雌雄各半,质量18~22 g,共108只,由青岛市药检局提供.随机分为两组,正常对照组12只;致伤组96只,又分为治疗组(n=72)与未治疗组(n=24),治疗组又分低浓度清蛋白组、高浓度清蛋白组、羟乙基淀粉组,每组24只小鼠.
　　1.2 各组动物处理
　　正常对照组腹腔注射15 mg/kg的生理盐水.致伤组分别腹腔注射15 mg/kg的LPS(Sigma公司),边注射边连续观察生命体征,小鼠呼吸频率显著增快,胸廓呼吸动度变浅,呼吸困难,双肺出现湿音;经活体处死取肺组织行苏木精-伊红染色,光镜下检查符合ARDS改变.低浓度清蛋白组尾静脉注射0.5 g/L人血清清蛋白10 μL/g体质量, 高浓度清蛋白组尾静脉注射50.0 g/L人血清清蛋白10 μL/g体质量,羟乙基淀粉组尾静脉注射60.0 g/L的羟乙基淀粉10 μL/g体质量.注射前禁食12 h,不禁水,注射后小鼠自由进食.正常对照组注射后4 h断颈取血;致伤后各组分别于注射后4、8、16、24 h断颈取血(每次取6只小鼠),3 000 r/min离心10 min,分离血清于-20 ℃冰箱内保存备用.
　　1.3 肺湿质量、干质量检测
　　于各时间点处死小鼠,取整个左肺测量湿质量,然后放入60 ℃烘箱烘干至恒质量,再测量干质量,计算湿质量/干质量(W/D)值.
　　1.4 CRP及PCT测定
　　应用CRP 96T及PCT 96T试剂盒(ADL公司),根据试剂盒提供的方法绘制标准曲线,并分析小鼠血清,得出CRP及PCT值.
　　1.5 统计学处理
　　结果均以x±s表示,采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[2]统计学软件进行数据处理.对数据先进行方差齐性检验,如果方差齐,采用方差分析和t检验;如果方差不齐采用非参数检验.
　　2 结 果
　　2.1 各组小鼠PCT检测结果比较
　　致伤各组PCT在致伤后24 h内随时间延长逐渐增高,各组组内比较,差异有显著性(H=17.97~21.60,q=3.28~6.23,P<0.01).与正常对照组比较,致伤各组4、8、16、24 h PCT均增高,差异有显著意义(H=26.43~27.44,q=4.08~6.88,P<0.01).与未治疗组比较,各治疗组8、16、24 h PCT降低,差异有显著性(q=4.08~6.27,P<0.01);与低浓度清蛋白组比较,高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组在各时间点PCT均降低,差异有显著性(q=4.13~6.45,P<0.05).高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组注射后4、8、16 h PCT差异无显著性(P>0.05).见表1.表1  各组 PCT水平比较(略)
　　2.2 各组小鼠CRP检测结果比较
　　与未治疗组比较,低浓度清蛋白组CRP下降,差异有显著性(t=23.37、28.32,H=15.16、19.55,q=4.08、4.58,P<0.01);高浓度清蛋白组16、24 h降低,差异有显著性(q=5.51、5.43,P<0.01).正常对照组CRP测不出;高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组4、8 h CRP均测不出,24 h差异无显著性(P>0.05).见表2.表2  各组CRP水平比较(略)
　　2.3 各组小鼠肺W/D比较
　　致伤组小鼠肺W/D 4 h 上升,8 h达到高峰,16 h有所下降,24 h稍有恢复,与正常对照组比较,差异有显著意义(H=23.15~24.70, q=4.28~6.87,P<0.01).与未治疗组比较, 低浓度清蛋白组小鼠8、16、24 h肺W/D无明显差异(P>0.05),高浓度清蛋白组小鼠16、24 h肺W/D下降(q=7.13、4.07,P<0.01),羟乙基淀粉组小鼠8、16、24 h肺W/D下降(q=3.94、6.04、3.67,P<0.01).高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组肺W/D各时间点比较,差异无显著性(P>0.05).见表3.表3  各组小鼠肺W/D的比较(略)
　　3 讨论
　　内毒素致组织损伤的过程中有多种炎症递质参与,其中CRP和PCT的作用越来越受到人们关注.PCT是降钙素的前肽,是一种无激素活性的糖蛋白,由116个氨基酸组成.在生理情况下,PCT通过甲状腺的C细胞产生并裂解出降钙素;严重感染时血PCT水平明显增高,此时PCT主要由甲状腺外组织产生[3].严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染,血浆PCT浓度异常升高,而且升高程度与感染严重程度及预后有关[4].OBERHOFFER等[5]对健康志愿者静脉注射一定量内毒素后进行连续观察显示,注射2 h后可在血浆中检出PCT,6~8 h PCT迅速上升,12~24 h缓慢达到平台期,2~3 d下降至正常范围.提示PCT检测在细菌性与非细菌性感染鉴别诊断及术后细菌感染并发症监测等方面有较好的临床应用价值.CRP也是常用的评价感染后炎症反应严重程度指标[6],但CRP增高还见于脑室内出血、胎粪吸入综合征等非感染性疾病[7],而且近年来CRP还被用于冠心病诊治中[8].
　　本文结果显示,随炎症时间的延长,PCT逐渐升高,24 h内呈上升趋势,与以往研究结果一致[4];随炎症时间的延长,CRP逐渐升高,但24 h内变化无明显规律性,与以往研究结果大致相符[9].经过治疗后,PCT较治疗前下降,表现出较好的依从性.治疗后CRP也下降,但高浓度清蛋白组和羟乙基淀粉组在4、8 h测不出,考虑可能是机体处于免疫抑制状态时,血浆中的CRP浓度无变化,不能很好地反映炎症程度的变化,与MULLER等[10]的研究结果一致.故CRP和PCT均可以评价ARDS治疗前后病情严重程度,但CRP不如PCT依从性好.
　　关于ARDS液体复苏治疗的研究很多,围绕是否用清蛋白的讨论始终是热点.2004年澳大利亚进行了一项大型的多中心随机双盲对照实验,研究应用40 g/L人血清清蛋白和生理盐水进行液体复苏对ICU病人病死率的影响.研究结果显示,人血清清蛋白组与生理盐水组病人的病死率差异无显著性,新出现的单器官和多器官衰竭的病例数相似,在ICU的平均时间、机械通气时间、肾脏替代治疗时间和住院时间方面差异亦无显著性.因此,该作者认为外源性人血清清蛋白在危重病人中的应用是安全的[11].
　　近年来,人血清清蛋白在治疗危重病中的作用渐得到肯定.人血清清蛋白的主要生理功能为扩充血容量、维持血浆胶体渗透压和营养作用[12],对低血容量病人可迅速扩容及维持心搏量,在抢救急性创伤性、出血性休克等危重病人时效果显著.人血清清蛋白在胶体渗透压的维持中约起到80%的作用.在各种原因所致的低清蛋白血症时,血浆胶体渗透压下降,液体向组织间隙扩散,形成组织水肿和胸、腹腔积液.根据Starling定律,足够的血浆胶体渗透压可减少甚至逆转血管内容物的渗出.外源性人血清清蛋白能通过其在血管内外的移动增加胶体渗透压,阻止液体从血管内转移到血管外.QUINLAN等[13]研究表明, 人血清清蛋白与呋塞米联合治疗ARDS后,病人体质量减小,氧合指数(动脉氧分压/吸入氧分压)显著改善,提示人血清清蛋白提高了肺泡血管的胶体渗透压,减少了血管内容物渗出至肺泡,从而改善肺泡功能.SONI等[14]报道,人血清清蛋白能够抑制多形核白细胞产生氧自由基,被认为是自由基清除剂,能改善羊模型ARDS预后.人血清清蛋白是否会参与炎症反应过程,通过减轻炎症反应起到治疗作用,目前尚没有定论.
　　本文结果显示,人血清清蛋白治疗后,CRP和PCT均较治疗前下降;低浓度清蛋白组W/D较治疗前无明显变化,高浓度清蛋白组较治疗前下降,表明50.0 g/L人血清清蛋白能起到治疗作用,证实了QUINLAN等[13]的研究结果.人血清清蛋白降低ARDS小鼠肺W/D,可能与人血清清蛋白提高血浆胶体渗透压,减轻肺水肿的作用有关;人血清清蛋白降低ARDS小鼠CRP和PCT,表明人血清清蛋白可能参与炎症反应过程,通过减轻炎症反应起到了治疗ARDS的作用.另有观点认为,羟乙基淀粉治疗可有效防止内毒素血症动物白细胞黏附,改善毛细血管灌注,减轻内皮细胞损伤,降低毛细血管通透性[15],还有抑制整合素、减轻全身和肺部炎症反应的功能.本实验选择60.0 g/L羟乙基淀粉做对照实验,结果显示羟乙基淀粉输入也能起到减少肺含水量、降低CRP和PCT的作用,证实羟乙基淀粉能减轻肺水肿和肺部炎症反应.本实验还显示,高浓度清蛋白组与羟乙基淀粉组CRP在4、8 h均测不出,在24 h无明显差异,两组PCT 在4、8、16 h差异无显著性,进一步证实了50.0 g/L人血清清蛋白能参与炎症反应过程,通过减轻肺部炎症反应起到治疗ARDS的作用.人血清清蛋白参与炎症反应过程的机制可能与人血清清蛋白抑制多形核白细胞产生氧自由基有关,也可能与人血清清蛋白与药物结合、降低药物浓度有关.具体的机制有待进一步研究.不同的胶体液相对分子质量不同,在循环系统中代谢的时间也不同,在安全性和有效性之间存在差异.本实验结果显示,50.0 g/L人血清清蛋白和60.0 g/L羟乙基淀粉在降低早期ARDS肺含水量和减轻炎症反应方面差异无显著性,如果要比较哪种胶体液更好,尚需更大规模的临床胶体液治疗实验.
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