【摘要】  目的 探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系.方法 应用免疫组化方法,分别测定空pIRES、野生型pIRESWTCD59和突变型pIRESMCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase3、Bcl2的表达.结果 转染野生型pIRESWTCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase3表达降低,Bcl2表达增高,差异有显著性(Z=3.462、3.958,P<0.05);转染突变型pIRESMCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase3表达降低,Bcl2表达增高,差异有显著性(Z=3.212、3.956,P<0.05);转染野生型pIRESWTCD59组与突变型pIRESMCD59组比较,Caspase3、Bcl2表达差异无显著性(Z=1.948、0.544;P>0.05).结论 CD59分子具有抑制凋亡的作用,而其保守位点W40与凋亡信号的传导无关.
　　【关键词】  抗原,CD59;点突变;Caspase3;基因,bcl2;细胞凋亡
　　CD59分子是一种广泛分布于各种组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇锚固型糖蛋白.近年来,国内外学者已在多种实体瘤细胞中,如子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤及肠道肿瘤等发现有CD59分子的过表达,并且其过表达与肿瘤细胞的失控性生长和恶性转化密切相关[1~4].揭示CD59分子与细胞凋亡之间的相关性,可为深入研究实体肿瘤的免疫治疗开辟一条新的途径.本文从CD59分子的基因水平,构建野生型CD59与突变型CD59(点突变W40)真核表达系统,筛选稳定细胞克隆,检测转染细胞中凋亡相关基因Caspase3、Bcl2的表达,研究CD59与凋亡因子的相关性.现将结果报告如下.
　　1  材料与方法
　　1.1  实验材料
　　人CD59 cDNA由美国哈佛大学医学院提供,CD59 单克隆抗体(McAb)FITC购自Coulter 公司; 羊抗人CD59 多克隆抗体购自SCB公司;辣根酶标记兔抗羊IgG购自北京中山生物技术有限公司;转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司;Caspase3、Bcl2免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司.
　　1.2  重组真核表达载体转染及表达
　　采用基因点突变技术使CD59 W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR(Overlap extension PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18TVector, EcoRⅠ单酶切野生型和突变型CD59基因,重组入真核表达质粒pIRES[5],利用阳离子脂质体(Lipfectamine 2000) 将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 进行表达,将构建的野生型pIRESWTCD59、突变型pIRESMCD59、空质粒pIRES应用阳离子脂质体(Lipfectamine 2000)法分别转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达,经G418筛选稳定细胞克隆,采用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)检测筛选CD59蛋白高表达株.
　　ELISA:收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质浓度为10 mg/L,用包被液以1∶1、1∶2、1∶4稀释待测标本和空pIRES对照,并分别设6个复孔,每孔加入100 μL样品,4 ℃包被18 h,封闭,加入羊抗人CD59抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG用3,3′二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)显色,测定450 nm波长处吸光度(A)值.
　　1.3  Caspase3、Bcl2免疫组织化学染色
　　取培养的对数生长期的细胞,以每孔5×105个接种于6孔培养板(每孔铺有一块盖玻片).培养48 h后,取出盖玻片用40 g/L的多聚甲醛固定,进行免疫组化染色.按照试剂盒的说明书操作.
　　1.4  结果判定
　　Caspase3阳性染色定位于细胞浆,Bcl2蛋白阳性表达定位于胞膜及(或)胞浆,均呈棕黄色染色.参照 FRORMOWITZ等[6]的方法,随机选取5个高倍视野(400倍),首先根据阳性细胞所占的百分比计分,阳性细胞数<5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,76%~100%为4分.再根据阳性细胞显色强度计分:无着色为0 分,轻度染色为1分,中度染色为2分,重度染色为 3 分.两者得分之和即为阳性蛋白表达,其中<1分为阴性,2~3分为弱阳性(+),4~5分为中等阳性(),6~7分为强阳性().
　　1.5  统计学分析
　　采用方差分析,两两比较采用q检验(NewmanKeuls法)和Wilcoxon秩和检验.
　　2  结果
　　2.1  CD59蛋白表达
　　在同一稀释度条件下,pIRESMCD59、pIRESWTCD59和pIRES组CD59蛋白表达比较,差异有显著性(F=141.80~317.60,q=19.648~32.661,P<0.01).见表1.
　　2.2  各组细胞中Caspase3、 Bcl2表达的比较
　　pIRESWTCD59组与pIRES组比较,Caspase3表达降低,Bcl2表达增高,差异有显著意义(Z=3.462、3.958,P<0.05);pIRESMCD59组与pIRES组比较,Caspase3表达降低,Bcl2表达增高,差异有显著意义(Z=3.212、3.956,P<0.05);而pIRESWTCD59组与pIRESMCD59组相比较,Caspase3、Bcl2表达差异无显著意义(Z=1.948、0.544,P>0.05).见表2.
　　表1  不同稀释度CD59蛋白质表达(略)
　　与pIRES组比较,F=141.80~317.60,*q=19.648~32.661,P<0.01
　　表2  各组转染细胞Caspase3、Bcl2表达的比较(略)
　　3  讨论
　　关于CD59 与凋亡的关系,国外已有不少报道.HUGHES等[7]应用CD59抗体再灌注治疗免疫性血栓性微血管病可使肾小球内皮细胞凋亡增加3.5倍.KAWANO等[8]检测传染性单核细胞增多症病人T细胞表面的CD59抗原表达并分析CD59与活性诱导成熟T细胞凋亡的关系显示,CD59弱表达的CD8+T细胞比 CD59强表达的CD8+T更易凋亡.JONES等[9]研究显示,感染性疾病病人的多形核白细胞补体调节蛋白CD59和CD55的表达与细胞的凋亡有关.
　　光镜观察可见,凋亡细胞体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落.本研究中观察到转染CD59的CHO细胞较未转染的CHO细胞或转染空质粒的CHO细胞凋亡细胞明显减少,细胞存活周期延长.
　　以Bcl2为代表的凋亡抑制基因能抑制多种因素造成的细胞凋亡.Bcl2是一个抑制凋亡的原癌基因,其编码的Bcl2蛋白是一种与细胞器,特别是与线粒体膜关联的稳定蛋白,主要存在于线粒体外膜、核膜及内质网膜,通过抑制内源性核酸内切酶活性、阻止细胞色素 C、黄素蛋白AIF从线粒体释放入细胞质,使凋亡效应蛋白酶链Caspase3不能激活以及抗氧化等机制发挥抗凋亡作用.本实验结果显示,Bcl2在转染CD59的CHO细胞和只转染空pIRES质粒的CHO细胞中均可见表达,但在转染CD59的CHO细胞中表达显著增加,提示CD59可上调Bcl2的表达.Caspase 半胱氨酸蛋白水解酶家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统,在细胞凋亡机制网络中居中心地位.在Caspase家族中,Caspase3处于蛋白酶级联反应的核心位置,在细胞凋亡信号传导过程中,被其上游蛋白酶切割激活后能直接参与切割细胞多种结构蛋白和功能蛋白,水解多种负责细胞生化和形态学改变的底物导致细胞以凋亡的形式解体.研究Caspase3的表达可反映细胞凋亡程度.本研究中转染CD59的细胞Caspase3表达明显下降,显示CD59对凋亡有一定的抑制作用.
　　本研究采用免疫组织化学染色方法检测转染CHO细胞表面所表达Caspase3、Bcl2的变化.结果显示,转染野生型和突变型CD59的CHO细胞Caspase3表达明显下降,说明CD59具有抑制凋亡的作用;野生型CD59 与突变型CD59转染细胞 的Caspase3表达差异无显著性,提示CD59 抑制凋亡信号转导与W40位点无关.Bcl2在转染CD59的CHO细胞中表达显著增加,可能的机制是CD59促进抗凋亡信号的形成,从而抑制细胞凋亡活化信号的传导,减弱凋亡信号传导通路下游的级联反应,Caspase3作为凋亡信号的执行者其表达减弱,提示CD59分子具有抗细胞凋亡的功能.本研究结果将为CD59在肿瘤逃逸中的作用提供理论依据.但是,CD59影响凋亡信号传导的具体途径还需要进一步的研究.
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