【摘要】  目的 观察视网膜色素变性过程中,视网膜外节层内组织细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)、神经组织蛋白S100、细胞间黏附分子1 (ICAM1)的表达情况,探讨其在视网膜色素变性过程中的作用及意义.方法 出生后25 d的RCS大鼠10只,雌雄不限,12 h光照12 h黑暗循环条件下饲养;以同龄SD大鼠10只作正常对照.苏木精伊红染色和免疫组化法检测视网膜外节等范围内组织细胞TNFα、S100、ICAM1等细胞因子的表达情况.结果 RCS大鼠视网膜组织中TNFα阳性表达强于SD大鼠,ICAM1和S100阳性表达弱于SD大鼠.结论 上述细胞因子的变化可能与视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜的吞噬、消化功能的改变有关.
　　【关键词】  视网膜炎,色素性;肿瘤坏死因子α;细胞黏附分子;S100蛋白质类;大鼠
　　视网膜色素变性为遗传性疾病,其基本病理过程已在有原发性视网膜色素变性的RCS大鼠视网膜中得到证实[1~3].RCS大鼠视网膜色素变性过程中,色素上皮细胞对视细胞外节盘膜的吞噬、消化功能的丧失以及盘膜崩解物的残留,有可能会引发相关细胞特性的改变,进而加速了视网膜色素变性的进程.本文对RCS大鼠视网膜色素变性过程中,视网膜外节等范围内组织细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)、神经组织蛋白S100、细胞间黏附分子1(ICAM1)的表达情况进行观察,以探讨其在视网膜色素变性过程中的作用及意义.
　　1  材料和方法
　　1.1  实验动物
　　出生后25 d的RCS大鼠10只,雌雄不限,12 h光照12 h黑暗循环条件下饲养.以同龄SD大鼠10只作正常对照.
　　1.2  主要实验试剂
　　兔抗鼠ICAM1抗体、兔抗鼠TNFα抗体、兔抗鼠S100抗体、羊抗兔二抗免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司.
　　1.3  实验标本采取
　　水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉动物后,取出眼球,生理盐水冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h,去除眼前节及玻璃体,常规石蜡包埋,沿眼球矢状面连续切片,切片厚度5 μm.
　　1.4  免疫组化阳性细胞的观察和分析
　　使用OLYMPAS BX50多功能显微镜,选取不同的视野观察并照相.运用SamplPCI显微图像分析系统测定视网膜外节层内组织细胞内免疫反应产物的平均吸光度值.在每张切片上随机选出两个视野进行计算机显微图像分析,测得其平均吸光度值.结果以±s表示,所得数据应用SPSS 10.0统计学软件进行t检验.
　　2  结果
　　2.1  苏木精伊红染色检查
　　正常SD大鼠出生25 d后,视网膜结构基本接近成熟状态,视杆层排列整齐,外节未见明显的紊乱及空泡现象;与SD大鼠相比,RCS大鼠出生25 d后视网膜视杆层厚度增加,内节变窄,外节增厚,有排列紊乱及空泡现象.
　　2.2  ICAM1免疫组化染色检测
　　无论正常SD大鼠还是RCS大鼠,在视网膜组织中均可见ICAM1阳性表达细胞,以膜表达为主,呈弥漫分布.RCS大鼠ICAM1的平均吸光度值为0.047 85±0.006 12,而SD大鼠为0.054 90±0.004 21,RCS大鼠平均吸光度值低于RCS大鼠,差异有显著性(t=3.213,P<0.05).
　　2.3  S100免疫组化染色检测
　　无论正常SD大鼠还是RCS大鼠,在视网膜组织中均可见S100阳性表达细胞.RCS大鼠S100平均吸光度值为0.061 14±0.003 52,SD大鼠平均吸光度值为0.146 25±0.003 82,RCS大鼠平均吸光度值低于RCS大鼠,差异有显著性(t=4.112,P<0.05).
　　2.4  TNFα免疫组化染色检测
　　无论正常SD大鼠还是RCS大鼠,在视网膜组织中均可见到TNFα阳性表达细胞.RCS大鼠TNFα平均吸光度值为0.148 20±0.002 35, SD大鼠平均吸光度值为0.096 03±0.002 38,RCS大鼠平均吸光度值高于RCS大鼠,差异有显著性(t=4.056,P<0.05).3  讨论
　　原发性视网膜色素变性的发生,主要由于视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜的吞噬、消化功能衰退,致使盘膜崩解物残留、堆集形成一层障碍物,妨碍营养物质从脉络膜到视网膜的转运,从而引起视细胞的进行性营养不良及逐渐变性和消失.至于色素上皮细胞吞噬消化功能衰竭的原因,目前还不清楚,可能与基因异常、某种或某些酶的缺乏有关.在免疫学方面,近年研究结果显示本病病人体液免疫、细胞免疫均有异常,玻璃体内有激活的T细胞、B细胞与巨噬细胞,视网膜色素上皮细胞表达HLADR抗原.这些证据提示RCS大鼠视网膜色素变性过程中,色素上皮细胞对视细胞外节盘膜的吞噬、消化功能的丧失以及盘膜崩解物的残留,有可能会引发相关细胞特性的改变,进而加速了视网膜色素变性的进程.临床上常见的包括原发性视网膜色素变性在内的视网膜疾病如视网膜静脉周围炎、视盘血管炎、视网膜脱离、视网膜母细胞瘤等,常常伴有细胞因子的表达异常等细胞生物学改变.在调节免疫功能、参与炎症发生过程中起重要作用的细胞因子TNFα具有刺激视网膜色素上皮细胞增生作用[4~6].LIMB等[7,8]在视网膜前膜细胞和基质中检测出细胞因子IL1(α、β)、IL6、TNFα、γ干扰素以及炎症相关分子E选择素、P选择素、黏附分子等.IL6、TNFα在视网膜外节盘膜中的普遍表达,说明增殖性玻璃体视网膜病变的形成过程中有细胞因子介导的炎症反应参与.而对于视网膜色素变性,大多数的研究集中在视网膜细胞的形态特征上,对相关细胞因子的作用报道甚少.我们在实验中观察到,无论正常SD大鼠还是RCS大鼠,在视网膜组织中均可见TNFα、ICAM1和S100阳性表达细胞,但RCS大鼠视网膜组织中TNFα阳性表达强于SD大鼠,ICAM1、S100阳性表达弱于SD大鼠.这也许预示着相关细胞因子在视网膜色素变性中发挥一定的作用.考虑到这些细胞因子的生物学效应,是否可以认为,RCS大鼠视网膜组织中ICAM1、S100阳性表达弱于SD大鼠,提示细胞间相互黏附的能力降低、组织自我修复能力减弱促进了视网膜视细胞外节盘膜细胞脱落,而盘膜崩解物残留、堆集形成的障碍物,引发了视网膜组织细胞TNFα的过度表达,甚或诱发一定程度的组织炎性反应,进一步妨碍营养物质从脉络膜到视网膜的转运,从而加重视细胞的进行性营养不良,其确切机制尚需要进一步研究证实.
　　【参考文献】
　　[1]BOULTON M, DAYHAW B P. The role of the retinal pigment epithelium: topographical variation and ageing changes[J]. Eye, 2001,15:384389.
　　[2]JIN G F, HURST J S, GODLEY B F. Rod outer segments mediate mitochondrial DNA damage and apoptosis in human retinal pigment epithelium[J]. Curr Eye Res, 2001,23:1119.
　　[3]王利华,刘薇,乔淑红,等. RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl2蛋白的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(1):710.
　　[4]杨萍,张惠蓉. 生长因子诱导视网膜色素上皮细胞增殖的协同作用研究[J]. 中华眼底病杂志, 1998,14:9597.
　　[5]ELNER S G, ELNER V M, BIAN Z M, et al. Human retinal pigment epithelial cell interleukin8 and monocyte chemotactic protein1 modulation by Tlymphocyte products[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997,38:446455.
　　[6]KISHI H, MISHIMA H K, YAMAM ASHITA U. Growth regulation of retinal pigment epithelial (RPE) cells in vitro[J]. Curr Eye Res, 1994,13:661668.
　　[7]LIMB G A, ALAM A, EARLEY O, et al. Distribution of cytokine proteins within epiretinal membranes in proliferative vitreoretinopathy[J]. Curr Eye Res, 1994,16:791798.
　　[8]LIMB G A, CHIGNELL A H, WOON H, et al. Evidence of chronic inflammation in retina excised after relaxing retinotomy for anterior proliferative vitreoretinopathy[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1996,234:213220.