【摘要】  目的 探讨针对CD59的siRNA(CD59siRNA)对人卵巢癌裸鼠移植瘤CD59的沉默效应及其抑瘤作用.方法 采用脂质体转染法将CD59干扰质粒(T组)和空质粒(V组)转染A2780细胞,获得稳定表达细胞株,将T组、V组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型,通过绘制肿瘤生长曲线、RTPCR和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对CD59基因及蛋白的沉默效应.结果 与V组和C组比较,T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01~30.41,P<0.05),CD59基因及蛋白表达减少(F=817.77、247.71,q=26.59~52.25,P<0.05).结论 特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达及卵巢癌在体内的生长.
　　【关键词】  学术期刊 抗原,CD59;卵巢肿瘤;RNA干扰;小鼠,裸
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the inhibition effect of CD59siRNA on CD59 gene and the growth of ovarian cancer in nude mice. Methods A2780 cells were stably transfected with shRNA plasmid (group T) and blank plasmid (group V), respectively, using Lipofectamne 2000. These cells and A2780 cells without trnsfection (group C) were subcutaneously injected into nude mice. The inhibition effect of CD59siRNA on tumor and the expreesion of CD59 was evaluated by tumor growth curve, RTPCR and immunohistochemistry (IHC). Results Compared with groups V and C, the gross tumor volume and weight were significantly inhibited in group T (F=301.88,5.39;q=4.01-30.41;P<0.05), RT PCR and IHC showed that the expression of CD59 mRNA and CD59 also decreased (F=817.77,247.71;q=26.59-52.25;P<0.05). Conclusion CD59siRNA can significantly suppress the expression of CD59 and growth of ovarian cancer in vivo.
　　[KEY WORDS] antigens, CD59; ovarian neoplasms; RNA interference; mice, nude
　　CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固糖蛋白,具有多种重要的免疫功能,其最重要的功能是作为补体系统终末阶段的调节蛋白,以同源限制的方式抑制补体攻膜复合物(MAC)的装配以保护宿主细胞免受补体溶解破坏[13].近年来,国内外文献报道,多种实体肿瘤细胞膜表面高表达CD59等一系列膜补体调节蛋白(mCRPs),使肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视[4],与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[5],同时也是导致众多肿瘤治疗失败的重要原因.本课题组前期利用RNA干扰技术(RNAi)构建了针对CD59的pSUPERCD59siRNA重组载体[67],并在体外实验证明了其对CD59的沉默效应.为深入了解CD59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响,本研究利用该重组载体,观察其在荷瘤裸鼠体内对肿瘤细胞CD59基因的沉默及抑瘤效应,为肿瘤基因治疗提供动物实验依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　人卵巢癌细胞系A2780细胞由本实验室保存;小鼠抗人CD59抗体购自BD Pharmingen公司;Lipofectamne 2000和总RNA提取试剂盒均购自Invitrogen公司;4~6周龄雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pSUPER质粒由我院罗兵教授惠赠; 重组质粒pSUPERCD59siRNA由本室构建和保存;Access RTPCR A1250试剂盒购自Promega公司;DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司;SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司.
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选 用 2.5 g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞,调整细胞密度达2×108/L,取0.5 mL加入24孔细胞培养板过夜培养,待细胞达到80%~90%汇合时进行转染.利用脂质体Lipofectamne 2000,将pSUPERCD59siRNA及空质粒pSUPER分别转染A2780细胞.G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞来源的细胞克隆,扩大培养.将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为干扰组(T组),空质粒整合的细胞克隆为阴性对照组(V组),未转染的A2780细胞为空白对照组(C组).
　　1.2.2 移植瘤裸鼠模型的建立 4~6周龄雌性裸鼠饲养在SPF环境中, 随机分为3组(T组、V组和C组),每组6只.采用常规培养细胞种植法,收集处于对数生长期的各组A2780细胞,于相应组每只裸鼠右腋皮下注射细胞5×106个(0.2 mL).连续观察30 d,记录肿瘤出现的时间;并于接种后每5 d测量肿瘤的长轴(L)和短轴(W),计算肿瘤体积(V),V=1/2×LW2,绘制肿瘤生长曲线.于第30天断颈处死裸鼠,摘取移植瘤称质量.
　　1.2.3 RTPCR检测裸鼠荷瘤组织CD59 mRNA的表达 Trizol试剂盒提取肿瘤组织总RNA,采用Access RTPCR A1250系统进行一步法检测CD59的mRNA表达.RTPCR反应参数为:48 ℃孵育45 min,94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,47℃退火1 min,68 ℃延伸2 min,40个循环后,68 ℃延伸7 min.以GAPDH作内参照.CD59引物序列[6]:上游引物5′ACAACTGTCCTAACCCAA3′;下游引物5′GAGTCACCAGCAGAAGAA3′;扩增片段为267 bp.GAPDH引物序列:上游引物5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′;下游引物5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′;扩增片段为509 bp.取3 μL扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳并照相.利用UVP 公司的Image Analysis Software 测定CD59 扩增片段的灰度值,将其与GAPDH扩增片段灰度值的比值作为CD59 mRNA 表达水平的半定量指标.
　　1.2.4 免疫组化SABC法检测肿瘤组织CD59蛋白的表达 免疫组化步骤按SABC免疫组化试剂盒说明书进行.采用Image Pro Plus 6.0 for Windows软件对免疫组织化学图像显色程度进行分析.对每张切片进行半定量分析[8]:高倍镜下(400倍)随机选取5个不重复的阳性反应视野,将阳性细胞的染色强度转变为量化指标,统计切片阳性染色细胞的平均吸光度(A),取5个视野的平均值作为该片的A值,A值大小与CD59蛋白和mRNA的含量成正比.
　　1.3 统计学处理方法
　　应用SPSS 16.0及PPMS 1.5[9]统计学软件进行数据处理,结果以±s表示,组间比较采用方差分析.
　　2 结 果
　　2.1 裸鼠移植瘤生长曲线
　　皮下注射卵巢癌A2780细胞6~8 d后,V组和C组的裸鼠均可观察到4~6 mm大小皮下肿瘤结节,并随时间的延长不断增大;而T组在接种后12~15 d才可观察到肿瘤结节,并且生长缓慢.18只裸鼠无死亡,所有肿瘤包块均无红肿和溃破.裸鼠肿瘤生长曲线(图1)显示,与V组和C组相比,T组肿瘤的生长明显受到抑制.接种后第30天,与V组和C组比较,T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01~30.41,P<0.05);V组与C组的肿瘤体积和质量比较,差异无显著意义(q=0.75、0.02,P>0.05),见表1.表1 各组裸鼠移植瘤的质量和体积
　　2.2 各组裸鼠移植瘤CD59 mRNA表达比较
　　各组裸鼠肿瘤组织中CD59 mRNA表达的RTPCR电泳检测结果见图2.CD59电泳条带的灰度值经同一标本的GAPDH条带的灰度值校正后分析显示,T组与V组、C组的CD59 mRNA表达相比较差异有显著意义(F=817.77,q=51.00、52.25,P<0.05),V组和C组差异无显著意义(q=1.25,P>0.05).见表2.
　　2.3 各组CD59蛋白在裸鼠卵巢癌移植瘤组织中的表达比较
　　CD59蛋白免疫组化阳性表达为棕黄色,主要定位于细胞膜,也可见于细胞浆.T组CD59蛋白表达与V组和C组比较明显降低(F=247.71,q=26.59、27.89,P<0.05),V组和C组相比差异无统计学意义(q=1.30,P>0.05).见表2.表2 各组裸鼠肿瘤组织中CD59 mRNA及蛋白表达比较
　　3 讨 论
　　CD59作为一种补体调节蛋白,以同源限制的方式抑制MAC的装配,保护宿主细胞免受补体溶解破坏,但由于它在多种实体肿瘤细胞中高表达,抑制了机体补体系统对肿瘤细胞的攻击, 使肿瘤逃避机体的免疫防御.肿瘤细胞的免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因[10],而使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或者不表达则是实体肿瘤免疫治疗中一个更加有效的策略.为此,本研究采用了先进的RNA干扰技术沉默CD59基因在卵巢癌细胞中的表达,探讨CD59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响.
　　RNAi技术是近年发展起来的沉默基因的新技术,是自然界生物体的一种遗传现象,主要是利用双链RNA特异性介导其互补同源mRNA序列的降解,从而特异性抑制目的蛋白的表达[11].2001 年,RNAi 技术被成功地应用于哺乳动物细胞,证明哺乳动物细胞中也存在RNAi 现象[12].RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域的发展极为迅速[13].由于siRNA具有高效敲除基因表达的作用,已被广大科学工作者用作研究基因功能和基因治疗的工具.
　　本课题组前期已经利用RNAi技术设计了针对CD59 mRNA的干扰序列并构建了pSUPERCD59siRNA重组载体,本研究将该质粒载体转染卵巢癌A2780细胞中并筛选出阳性克隆,获得稳定转染的细胞株,同时设立空质粒(pSUPER质粒)转染及未转染的A2780细胞作为对照.通过建立卵巢癌移植瘤模型,观察到pSUPERCD59siRNA重组载体能明显抑制肿瘤形成的时间及肿瘤生长.与阴性对照组和空白对照组比较,干扰组CD59的mRNA和蛋白表达明显被抑制,肿瘤的体积显著减小,表明pSUPERsiCD59干扰质粒在体内可抑制CD59的表达,CD59的沉默使其失去抑制MAC形成的功能,使卵巢癌A2780细胞抗补体活性下降,有利于机体肿瘤的清除.
　　综上所述,pSUPERsiCD59转录载体在体内外均实验证实了其沉默CD59的效应,并且也说明了CD59在肿瘤生长及肿瘤逃逸中的作用,为肿瘤的免疫逃逸和靶向治疗研究提供了一种全新的理念及实验依据,具有重要的理论价值及广阔的临床应用前景.
　　【参考文献】
　　[1]FARKAS I, BARANYI L, ISHIKAWA Y, et al. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhibits ion channel formation by homologous C5b8 as well as C5b9[J]. J Physiology, 2002,539(2):537545.
　　[2]BROOIMANS R A, VAN WIERINGEN P A, VAN ES L A, et al. Relative roles of decayaccelerating factor,membrane cofactor protein,and CD59 in the protection of human endothelial cells against complementmediated lysis[J]. Eur J Immunol, 1992,22(12):31353140.
　　[3]MIYAGAWA S, SHIRAKURA R, MALSUMIGA G, et al. Possible of prevention of hyperacute rejection by DAF and CD59 in xenotansplantation[J]. Transplant Proc, 1994,26(3):12351238.
　　[4]FISHEISON Z, DONIN N, ZELL S, et al. Obstacles to cancer immunotherapy: expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumors[J]. Mol Immunol, 2003,40(24):109123.
　　[5]FONSATTI E, ALTOMONTE M, CORAL S. Emerging role of protectin (CD59) in humoral immunotherapy of solid malignancies [J]. Clin Ter, 2000,151(3):187193.
　　[6]石学香,高美华,李先平,等. siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2008,24(12):11641166.
　　[7]石学香,高美华,臧金林. 人CD59 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):13.
　　[8]刘明社,赵中夫,张国英,等. RNA干扰Fas基因表达的免疫组化半定量分析[J]. 长治医学院学报, 2007,21(6):404406.
　　[9]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.
　　[10]GAVIN P D, LLOYD J O, ROBERT D S. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting[J]. Immunity, 2004,21(2):137148.
　　[11]FIRE A, XU S, MONTGOMERY M K, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabdits elegans[J]. Nature, 1998,391(6669):806811.
　　[12]ELBASHIR S M, HARBORTH J, LENDECKEL W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interfence in culture mammalian cells [J]. Nature, 2001,411(6836):494498.
　　[13]MUNKACSY G, TULASSAY Z, GYORFFY B. RNA interference and its clinical applications [J]. Orv Hetil, 2007,148(47):22352240.