【摘要】  目的 研究低功率HeNe激光照射对Jurkat细胞CD59活化途径的影响.方法 将前期培养的Jurkat细胞随机平均分为3组:A组细胞不做任何处理, B组细胞每日定时进行7 min的HeNe激光照射,C组细胞每日定时进行10 min的HeNe激光照射.1周后用CD59单克隆抗体作用Jurkat细胞,用MTT法检测Jurkat细胞增殖情况,激光共聚焦方法观察细胞内Ca2+浓度变化,流式细胞术检测Jurkat细胞CD25表达.结果 B、C组Jurkat细胞增殖率、Ca2+浓度和CD25表达均高于A组(F=41.390~63.938,q=10.907~24.497,P<0.01); B组和C组间比较差异无显著性(P>0.05).结论 低功率HeNe激光照射可以促进Jurkat细胞经由CD59单克隆抗体刺激后的活化,增强活化信号的传导.
　　【关键词】  抗原,CD59;Jurkat细胞;激光
　　[ABSTRACT] Objective To study the effect of lowpower HeNe laser irradiation on CD59 activate channel in Jurkat cells. Methods Prophase cultural Jurkat cells were evenly randomized to three groups: group A was served as normal control; group B, Jurkat cells were irradiated 7 min daily; group C, the cells were irradiated 10 min daily. One week later,CD59 monoclonal antibody was applied to act on Jurkat cells, which were detected by transformation test (MTT assay). Laser confocal technique was employed to observe the changes of calcium ion concentration (CIC) within the cells; flow cytometry to detect the expression of CD25 in Jurkat cells. Results The growth rate of Jurkat cells, CIC and expression of CD25 in groups B and C were all higher than that in group A (F=41.390-63.938,q=10.907-24.497,P<0.01). As compared between groups B and C, the difference being not significant (P>0.05). Conclusion Lowpower HeNe laser radiation enhances the activation of Jurkat cells that stimulated by CD59, strengthening the conduction of activation signals.
　　[KEY WORDS] antigen, CD59; Jurkat cell; laser
　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜表面的糖蛋白,广泛分布于造血细胞、非造血细胞及多种组织细胞表面,除了已被广泛认知的补体调节功能外[12],还参与了T细胞的黏附及活化信号的传导.近年研究发现,肿瘤病人常常会出现免疫细胞CD59表达降低、活化能力减弱及免疫功能低下的情况[34],这就导致了肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤而持续生长,是造成肿瘤逃逸的重要因素之一.HeNe激光具有光、热、磁、压等效应以及生物刺激作用,可以增强细胞的活化信号,促进细胞的增殖[56].本研究采用低功率HeNe激光照射Jurkat细胞,以探讨低功率HeNe激光对Jurkat细胞CD59的表达及活化信号转导的影响.现将结果报告如下.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与试剂
　　人白血病T淋巴细胞系Jurkat细胞由本室保存. RPMI 1640 培养液及标准胎牛血清购于Gibco公司, MTT由中国医学科学院血液研究所提供,Hepes购于Solarbio公司,Fluo3/AM购于Biotium公司,FITC标记及辣根酶标记鼠抗人IgG购于北京中杉金桥公司. HNZSQⅡ型氦氖激光照射器为上海医用激光仪器厂产品.
　　1.2 细胞分组与照射
　　选取生长状态良好的Jurkat细胞,经过吹打混匀后,调整细胞密度为5×1010/L的细胞悬液,将0.1 mL的细胞悬液滴加于24孔扳中.将24个板孔分成3组,每组8孔.A组为对照组,不进行照射;B组每日进行7 min的HeNe激光照射;C组每日进行10 min的HeNe激光照射.采用HNZSQⅡ型氦氖激光照射器,输出功率为24 mW,能量密度为76.43 J/cm2,照射距离为50 cm,光斑直径为0.5 cm,原束照射,每日调整细胞密度为5×1010/L,10 d后收集细胞.
　　1.3 MTT法检测Jurkat细胞增殖活性
　　调整A、B和C组细胞密度为5×107/L,加入96 孔板中,每孔100 μL.设定空白对照组、ConA对照组、ConA+CD59mAb组,每组各设8个复孔,每孔加试剂50 μL.放入含体积分数0.05 CO2的37 ℃温箱中孵育48 h.加MTT,每孔10 μL,振荡混匀,放入含体积分数0.05 CO2 的37 ℃温箱中孵育4 h.加入100 g/L SDS0.02 mol/L HCl,每孔100 μL,充分吹打混匀20 min 至完全溶解.酶标检测仪测570 nm 波长处吸光度(A)值.以各样本测定孔A(A1) 值减对照孔A(A2)值,求得A差值(△A),计算Jurkat细胞增殖率.Jurkat细胞增殖率=△A/A2×100%.重复3次取平均值.
　　1.4 激光共聚焦方法检测细胞内钙离子浓度
　　取前期准备的Jurkat细胞,调整细胞密度为5×1010/L,用Hepes缓冲液(pH 7.4)将细胞清洗3次,加入10 μmol/L FLUO3/AM 100 μL,37 ℃孵育40 min.然后以1 000 r/min离心10 min,吸弃FLUO3/AM上清液,使用Hepes缓冲液(pH 7.4)将细胞清洗3次,加入0.5 mL Hepes缓冲液.3组Jurkat细胞均加入CD59mAb,于10 min内使用Nikon激光共聚焦显微镜检测细胞内的钙离子浓度的变化情况.
　　1.5 流式细胞术检测CD59mAb作用后细胞的CD25表达
　　Jurkat细胞中加入1 mg/L CD59mAb,37 ℃孵育48 h.调整细胞密度为5×1010/L,分别吸取250 μL不同组细胞悬液放入1、2、3、4号EP管中,分别设对照组和同型对照组,加入FITC标记的抗人CD25各10 μL,混匀后,4 ℃避光作用30 min,以50 g/L清蛋白PBS洗2次,每次5 min.多聚甲醛固定,避光保存24 h内采用流式细胞仪检测细胞CD25表达情况.
　　1.6 统计学处理
　　结果以±s表示,数据间比较采用方差分析,应用SPSS 16.0软件进行数据处理.
　　2 结 果
　　2.1 各组Jurkat细胞增殖情况比较
　　经48 h培养后显示, B组Jurkat细胞增殖率为(74.604±1.927)%、C组为(73.923±2.434)%、A组为(48.028±8.70)%,A组和B、C组比较差异均有显著意义(F=63.938,q=24.497、23.869,P<0.01);B组C组间比较差异则没有显著意义(P>0.05).
　　2.2 各组Ca2+浓度变化情况比较
　　加入CD59mAb 1 min后Jurkat细胞胞浆内Ca2+浓度均明显升高.A组细胞升高为(287.0±39.0)%,而B、C组细胞分别为(433.0±39.0)%、(439.0±36.0)%.A组和B、C组比较差异有显著性(F=41.390,q=10.907、11.364,P<0.01);B、C组间比较差异无显著性(P>0.05).
　　2.3 各组CD59mAb作用后Jurkat细胞CD25的表达情况比较
　　加CD59mAb作用48 h后, A组Jurkat细胞CD25表达量为512.17±70.44,B组为739.85±40.42,C组为727.10±41.66.B、C组Jurkat细胞CD25表达量明显高于A组,差异有显著意义(F=47.360,q=19.565、21.320,P<0.01);B、C组间比较差异无显著性(P>0.05).
　　3 讨 论
　　CD59广泛分布于体内多种细胞表面,多年前即被证实拥有补体调节功能.近年来国内外大量研究证实,在氨基酸水平上,CD59与鼠类的T细胞激活蛋白相似,这为其可能在T细胞信号传导中发挥作用提供了证据;人CD59经特异单克隆抗体交联后,可引起Ca2+的释放及脂筏相关信号分子的活化;中性粒细胞表达的CD59用特异抗体交联后,也可使特异酪氨酸激酶活化[8].由此可见,CD59在细胞的活化信号转导中也发挥着重要的作用.
　　实验已证明,低功率HeNe激光具有光化学效应,照射小鼠胸腺能够影响其淋巴细胞的活性[9].其光、热、磁、压等效应能有效地增强机体的代谢过程,增强酶的活性,加速蛋白合成,可以引起各种细胞反应途径包括蛋白激活、去磷酸化以及第二信使(Ca2+、cAMP)变化,可以在T细胞生长活化过程中发挥有效作用,对T细胞的活化信号产生影响.本研究检测HeNe激光照射后Jurkat细胞经CD59mAb刺激后的增殖情况,结果表明,B、C组Jurkat细胞增殖率高于A组.可见,激光照射后CD59表达增加,Jurkat细胞活化信号增强,分化为效应细胞能力升高.
　　刺激CD59可对T细胞的Ca2+浓度产生影响.细胞激活信号的传导过程中,CD59发挥作用的可能机制为:①作为CD2的第二配体,参与T细胞的黏附;②其参与构成细胞膜微结构--脂筏,脂筏为淋巴细胞抗原受体介导的信号传导提供平台;③作为一种共刺激分子,参与T细胞的活化,CD59活化导致TCR/ZAP70亚单位活化.而后PLCγ途径发挥重要作用,活化的PLCγ通过分解二磷酸磷脂酰基醇(PIP2),激活三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG).前者使细胞内Ca2+浓度持续升高,后者激活蛋白激酶C(PKC).Ca2+作为细胞内第二信使,其作用的分子基础是与钙调蛋白(CaM)结合形成Ca2+CaM复合物,激活其靶酶,向下游传递信号.本研究以CD59mAb作用Jurkat细胞,产生钙流,且经过激光照射后的细胞Ca2+浓度升高程度明显高于未照射组,充分说明了低强度激光照射上调了CD59的表达.
　　CD25是T细胞中期活化抗原,白细胞介素2受体(IL2R)α链,静息T细胞表达很少,活化后则大量诱导表达,与IL2Rβ、IL2Rγ链共同构成高亲和力的IL2R,以供IL2结合并选择性支持经抗原刺激而活化的T细胞进行扩增[10].所以,CD25是T细胞活化的标志之一.本研究用CD59mAb刺激Jurkat细胞表达CD25,结果显示,B、C组活化为CD25 T细胞的量要高于A组.同样证明,激光照射后T细胞的CD59表达增高.
　　综上所述,经由低功率的HeNe激光照射后,Jurkat细胞CD59表达上调,活化信号明显增强, Jurkat细胞分化为效应细胞的能力加强.而临床上常常出现肿瘤病人免疫细胞CD59表达降低,导致免疫功能低下的情况,这就为临床HeNe激光治疗肿瘤提供了新的思路和理论依据,具有重要的理论价值.
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