【摘要】  目的 研究高铁饮食对C57BL/6小鼠黑质(SN)和中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元的不同损伤.方法 将C57BL/6小鼠随机分为高铁饮食组和正常对照组,利用免疫组织化学染色法及铁染色技术检测两组小鼠SN和VTA的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数及铁水平的变化.结果 高铁饮食组SN的TH阳性细胞数较正常对照组明显减少(t=16.31,P<0.001),铁染色阳性细胞数较对照组明显增高(t=13.01,P<0.001).而两组小鼠VTA的TH阳性细胞数及铁染色阳性细胞数均无明显差别.结论 铁在SN的选择性聚积参与了SN多巴胺能神经元的选择性损伤.
　　【关键词】  铁;黑质;腹侧被盖区;神经元;创伤和损伤;酪氨酸单氧化酶;小鼠
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ferric diet on the degeneration of dopaminergic neurons between the substantia nigra (SN) and the ventral tegmental area (VTA) in C57BL/6 mice. Methods The male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups: ferricdiet group and normaldiet group. Tyrosine hydroxylase (TH) positive cells and iron positive cells in SN and VTA were determined using immunohistochemistry and iron staining. Results Compared with those of the control group, the number of THpositive cells in SN was significantly decreased (t=16.31,P<0.001) and the number of ironpositive cells significantly increased (t=13.01,P<0.001) in ferricdiet group. The numbers of both THpositive cells and ironpositive cells were not significantly different in the VTA between the two groups. Conclusion Selective iron accumulation in SN is involved in the selective degeneration of dopamine neurons in SN.
　　[KEY WORDS] lron; substantia nigra; ventral tegmental area; neurons; wound and injury; tyrosine 3monooxygenase; mice
　　帕金森病(PD)是一种多发于中老年人群的中枢神经系统退行性疾病,其典型的病理特征为黑质(SN)多巴胺能神经元缺失.中枢神经系统内有两条主要的多巴胺能通路:一条自SN投射到纹状体;另一条为代谢通路,起自中脑腹侧被盖区(VTA),终止于伏核以及其他的边缘系统.PD病人多巴胺能神经元的退行性变化主要发生在SN,而VTA却极少累及[1].这一现象在各种实验动物模型上也得到了证实,例如6羟基多巴胺(6OHDA)处理的大鼠模型、1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)处理的小鼠模型以及鱼藤酮处理的灵长类动物模型等[2].其机制可能与不同多巴胺能神经通路对氧化应激的反应不同,以及其脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达不同有关[2].但其确切机制仍然不是十分清楚.本实验采用高铁饮食饲养小鼠方法,观察了SN和VTA的酪氨酸羟化酶(TH)和铁水平的变化,以探讨SN多巴胺能神经元的选择性损伤及其机制.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物 C57BL/6雄性小鼠16只,15~17 d龄,由北京维通利华实验动物中心提供.
　　1.1.2 试剂 右旋糖酐铁(美国Sigma公司)、鼠抗兔TH抗体(美国Sigma公司)、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司),其余试剂购自本地代理商.
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验动物模型的建立 将16只小鼠编号后根据随机数字表随机分为2组,每组8只.高铁饮食组每日给予含质量分数0.025的右旋糖酐铁饮食,自由取食至出生后2个月;正常对照组每日正常饮食至出生后2个月.
　　1.2.2 组织准备 用80 g/L水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉动物,灌注固定取材,脑组织采用40 g/L多聚甲醛固定24 h,然后置200 g/L蔗糖冷冻保护溶液中,待脑组织沉底后再移入300 g/L蔗糖冷冻保护溶液中,行连续冠状冰冻切片,片厚为16 μm,载玻片预先用多聚赖氨酸处理,烤箱烤干后保存.
　　1.2.3 免疫组织化学染色 切片在空气中放置至室温后,用0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次,浸泡在体积分数为0.01的H2O2甲醇溶液中孵育30 min以除去内源性过氧化物酶.PBS冲洗3次后用体积分数0.015正常山羊血清37 ℃封闭30 min,用TH抗体(1∶5 000)孵育,并置于湿盒中于4 ℃冰箱内过夜.PBS冲洗后,用生物素化山羊抗鼠二抗工作液孵育30 min,PBS冲洗3次,用辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育30 min,PBS冲洗3次,用DAB试剂盒显色2 min,观察其反应.不加一抗的切片不显色[3].
　　1.2.4 铁染色 组织切片处理同TH免疫组化染色,采用PBS冲洗3次后,将切片置于等量体积分数0.02的盐酸和20 g/L亚铁氰化钾的混合液中孵育30 min,PBS冲洗后浸泡在体积分数为0.01的H2O2甲醇溶液中孵育20 min以除去内源性过氧化物酶,DAB显色.
　　1.3 统计学处理
　　统计SN及VTA每个高倍视野(400倍)内的阳性细胞数目并取平均值.实验结果以均数±标准差表示.采用PPMS 1.5[4]软件进行统计学处理,两组之间均数的比较采用t检验.
　　2 结 果
　　2.1 免疫组化染色
　　高铁饮食组、正常对照组小鼠SN内TH阳性细胞数分别为27.86±1.07、40.14±1.68,高铁饮食组较正常对照组明显减少(t=16.31,P<0.001).高铁饮食组、正常对照组小鼠VTA内TH阳性细胞数分别为56.01±1.63、59.50±6.14,两组比较差异无统计学意义(t=1.10,P>0.05).见图1.
　　A、B:正常对照组SN、VTA 400倍视野TH阳性细胞数;C、D:高铁饮食组SN、VTA 400倍视野TH阳性细胞数.
　　图1 两组SN和VTA内TH阳性细胞数的变化
　　2.2 铁染色
　　高铁饮食组、正常对照组SN内铁染色阳性细胞数分别为34.03±2.68、15.17±2.32,高铁饮食组较正常对照组明显增多(t=13.01,P<0.001).高铁饮食组、正常对照组小鼠VTA内铁染色阳性细胞数分别为3.51±1.05、2.33±1.03,两组比较差异无统计学意义(t=1.95,P>0.05).
　　3 讨 论
　　PD的病理学特征为SN多巴胺能神经元的选择性缺失及路易小体的形成.PD病人多巴胺能神经元的退行性变化主要发生在SN,而VTA却极少累及[1].本实验在高铁饮食动物模型上得到了一致的结果.高铁饮食动物SN内的TH阳性细胞数明显降低,而VTA内TH阳性细胞数则未见明显变化,但SN多巴胺能神经元选择性损伤的机制仍不是十分清楚.
　　已有文献报道,PD病人的SN铁水平明显升高[5].一般认为,铁离子在多巴胺能神经元细胞内的损伤机制如下:多巴胺在单胺氧化酶B(MAOB)的作用下产生H2O2,Fe2+ 可与H2O2通过Fenton 反应,生成具有高度细胞毒作用的OH·(H2O2+Fe2+→OH·+ OH-+ Fe3+)[6];OH·可造成蛋白质、核酸和细胞膜的损伤, 从而造成细胞的死亡[7].PD的另一病理特征是路易小体的形成,而且PD病人死后尸体解剖也发现路易小体周围有铁环绕[8],提示铁对SN多巴胺能神经元损伤可能与路易小体形成有关.路易小体的主要成分是alphasynuclein,文献报道,alphasynuclein在铁的存在下可以生成有毒性的不溶的聚集体[9].所以,铁也可能通过导致路易小体形成而导致SN多巴胺能神经元死亡.
　　本室前期研究已显示,直接在大鼠SN内注射FeCl3可使损毁侧多巴胺释放量和含量均降低[10].口服铁螯合剂可以抵抗铁导致的损伤作用[11].同时,在MES23.5细胞系上也证实了铁对多巴胺能神经元的损伤作用[12].提示铁可能参与了SN多巴胺能神经元的选择性损伤.因此,本实验在高铁饮食动物模型上,观察了SN和VTA的铁染色阳性细胞数.结果显示,给予高铁饮食后,SN内铁水平明显增高,而VTA内铁水平未见明显变化,提示铁在SN的选择性聚积和TH阳性细胞数减少间存在着相关性,SN和VTA内铁含量差异可能是导致SN和VTA多巴胺能神经元不同损伤的原因之一.
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