【摘要】  目的 研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响.方法 构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RTPCR及Western blot方法检测细胞表面CD59 mRNA及蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖抑制率.结果 成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与WTA2780比较均明显下降(t=9.21、7.20,P<0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P<0.05).结论 CD59配体肽基因可影响人卵巢癌细胞A2780表面CD59的表达,有望用于肿瘤治疗.
　　【关键词】  抗原,CD59;A2780细胞;重组融合蛋白质类
　　[ABSTRACT] Objective To study the influence of CD59 ligandpeptide on ovarian cancer cell CD59. Methods A eukaryotic expression recombinant of ligandpeptide of CD59 was created and transfected into A2780 cells. Stable expressive cell clone was screened by addition of G418. The level of CD59 mRNA and protein was detected by RTPCR; and cytostasis rate detected by MTT. Results A eukaryotic expression recombinant of ligandpeptide of CD59 was successfully constructed. The expressions of CD59 mRNA and protein in transfected A2780 cells were lower than that of WTA2780 (t=9.21,7.20;P<0.05), and cytostasis rate obviously increased (F=5.417,q=3.93,P<0.05). Conclusion CD59 Ligandpeptide can influence the expression of CD59 mRNA and protein on the surface of A2780 cells, which is hope to be used for oncotherapy.
　　[KEY WORDS] antigens, CD59; A2780 cells; recombinant fusion proteins
　　CD59是一种广泛分布于细胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇锚固糖蛋白,具有抑制补体效应的功能.首先,CD59以同源限制形式抑制新生补体攻膜复合物(MAC)形成,保护自身正常组织细胞免遭补体溶细胞损害[1].其次,在多种生殖系统肿瘤细胞中发现CD59的过表达,提示CD59可能与肿瘤细胞逃脱免疫监视相关.对CD59活性位点的研究显示, Trp40对于CD59分子正常发挥生物活性具有重要作用[2].本科室利用噬菌体肽库筛选与CD59高效结合的短肽,并合成CD59配体肽基因.实验结果显示,CD59配体肽基因可显著增强补体对肿瘤细胞的溶解作用[3],说明CD59配体肽基因可以结合并封闭正常CD59 分子的补体结合位点,具有中和正常CD59分子活性的作用.本研究旨在进一步探讨CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响.现将结果报告如下.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 质粒、菌株与细胞株 pIRES真核表达质粒、大肠杆菌DH5α与人卵巢癌细胞A2780均由本教研室保存;PMD18Tvector由大连TaKaRa公司生产.
　　1.1.2 主要试剂 PCR、RTPCR所需引物由上海生物工程技术服务有限公司生产;限制性内切酶EcoRⅠ、NheⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA ligase及PCR、RTPCR检测试剂盒均购自大连TaKaRa公司; ECM Kit由美国Boster公司生产;Lipofectin Reagen 2000由美国Invitrogen公司生产.
　　1.2 方法
　　1.2.1 基因序列的获得 根据CD59配体肽氨基酸序列,得到完整CD59配体肽基因序列.以其碱基序列为基础,设计2条单链,二者互为引物,各含54个碱基且于3′端19位碱基处反向互补.行搭桥PCR获得带酶切位点(EcoRⅠ、NheⅠ)的CD59配体肽基因序列[4].
　　1.2.2 CD59配体pIRES真核表达重组体的构建及鉴定 CD59配体肽基因的制备:以A、B链互为模板引物行PCR反应.反应条件:首先94 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性30 s,46 ℃退火1 min,68 ℃延伸2 min,5个循环;最后68 ℃延伸5 min.取上述扩增产物2 μL在30 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳. CD59配体pIRES真核表达重组体构建及鉴定:spdsDNA片段回收纯化,与Tvector 4 ℃过夜连接,连接产物TSS法转化感受态大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素及蓝白斑筛选,随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌,小提质粒.质粒分别行PCR、NheⅠ单酶切、DNA测序法鉴定CD59配体pIRES18T阳性重组子.CD59配体pIRES18T阳性重组子质粒行EcoRⅠ、NheⅠ双酶切,回收纯化外源基因片段.pIRES真核表达质粒的获得与纯化与外源基因片段获得方法相同.外源基因片段与载体的连接、连接产物的转化、阳性重组子质粒PCR及DNA测序鉴定方法同sp18T重组克隆载体.质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切后,取酶切产物5 μL在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳.
　　1.2.3 人卵巢癌细胞A2780的转染及稳定转染细胞系的建立 参照《分子克隆实验指南(第3版)》中的方法进行转染,G418压力筛选建立稳定转染细胞系.CD59配体pIRES重组质粒转染细胞命名为CD59配体A2780, pIRES空质粒转染细胞命名为WTA2780.
　　1.2.4 RTPCR方法检测转染细胞CD59配体肽基因mRNA 的表达 采用BIOZOL 总RNA 提取试剂分别提取CD59配体A2780和WTA2780总RNA.鉴定CD59配体肽基因表达所用的上游引物为5′CATGTCATTGGCCTTGGTGT3′,下游引物为5′ACATTGGGTGCATTGGTAGA3′.RTPCR采用两步法,首先以总RNA为模板.42 ℃反转录反应45 min;然后以反转录液为模板, 反应条件:94 ℃预变性3 min;然后94 ℃变性30 s,49 ℃退火50 s,68 ℃延伸1 min,共30个循环;最后72 ℃延伸5 min.取扩增产物5 μL在30 g/L琼脂糖凝胶上电泳.
　　1.2.5 RTPCR检测转染细胞CD59 mRNA 的表达 采用BIOZOL总RNA 提取试剂盒分别提取CD59配体A2780和WTA2780总RNA.鉴定CD59表达的上游引物为5′CTGCCATTCAGGTCATAGCC3′,下游引物为5′GAGAAATGGAGTCACCAGCA3′.鉴定内参照GAPDH表达的上游引物为5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′,下游引物为5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′. CD59 cDNA PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;然后94 ℃变性30 s,47 ℃退火52 s,68 ℃延伸1 min,32个循环;最后70℃延伸5 min.GAPDH cDNA PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;然后94 ℃变性30 s,45℃退火1 min,68 ℃延伸1 min,25个循环;最后68 ℃延伸5 min.取扩增产物CD59 7 μL及GAPDH 2 μL在30 g/L琼脂糖凝胶上电泳.
　　1.2.6 Western blot方法检测转染细胞CD59蛋白的表达 取等量蛋白质在150 g/L的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳后聚丙烯酰胺凝胶电转印至硝基纤维素膜上,4 ℃过夜封闭;加入CD59 mAb 10 mL(1∶400), 37 ℃孵育1 h后洗膜;加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgM 10 mL (1∶4 000),37 ℃孵育1 h后洗膜;加入化学发光显色剂ECM显色,暗室条件下X线片感光1 min,显影.用Band Scan分析软件行条带灰度扫描,求其百分比数值后进行统计学分析.
　　1.2.7 兔抗人A2780细胞抗血清的制备 A2780细胞用含体积分数0.10小牛血清的RPMI 1640培养液培养至细胞生长状态良好.用2.5 g/L的胰酶消化成单细胞悬液,PBS洗3次,调整细胞密度至2×1011/ L,免疫家兔.免疫结束10 d后,心脏采血并自然沉淀分离血清(抗体效价为1∶5 120).
　　1.2.8 MTT法检测细胞增殖抑制率 分别收集CD59配体A2780、WTA2780及正常A2780细胞,RPMI 1640基础培养液调整细胞密度至2×108/L,置于96孔培养板中,每孔50 μL.每标本设6个复孔.每孔加兔抗人A2780细胞抗血清及含体积分数0.08新鲜人血清各10 μL, 37 ℃孵育1 h,每孔加浓度为5 g/L的MTT 10 μL,37 ℃孵育4 h,弃上清后加入100 μL DMSO,轻轻吹打混匀后置摇床上50 r/min震荡溶解15 min.于波长630 nm处测各孔吸光度(A)值并计算细胞增殖抑制率.细胞增殖抑制率=[1-(实验组A-阴性对照组A)]/(阳性对照组A-阴性对照组A)×100%.重复3次取其平均值.
　　1.2.9 统计学处理 利用SSPS 15.0及PPMS1.5[5]统计软件包进行统计学分析.
　　2 结 果
　　2.1 CD59配体pIRES真核表达重组体PCR及酶切鉴定
　　CD59配体pIRES真核表达重组体进行质粒PCR,电泳后可见长63 bp清晰条带(图1),CD59配体pIRES真核表达重组体行质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切,电泳可见长78 bp 清晰条带(图2),证实CD59配体pIRES真核表达重组体构建成功
　　2.3 RTPCR检测CD59配体肽基因mRNA表达
　　CD59配体A2780的PCR产物电泳后可见长约63 bp清晰条带(图3),证实CD59配体肽真核表达重组体成功转染A2780细胞.
　　2.4 RTPCR检测CD59 mRNA 的表达 CD59配体A2780及WTA2780产物电泳后均可见长约304 bp清晰条带,其GAPDH 可见长约509 bp清晰条带(图4).CD59配体A2780细胞组灰度百分值为(19.699±7.253),WTA2780细胞组灰度百分值为(9.857±6.882),两组比较差异有显著意义(t=9.21,P<0.05).
　　2.5 Western blot方法检测转染细胞CD59蛋白的水平
　　CD59配体A2780细胞组、WTA2780细胞组灰度百分值分别为2.873±0.545、1.580±0.440,两组比较差异有显著性(t=7.20,P<0.05).
　　2.6 锥虫蓝染色测定补体溶细胞功能
　　CD59配体A2780细胞组、WTA2780细胞组及正常A2780细胞组细胞增殖抑制率分别为31.685±3.427、25.732±2.947、26.019±4.126,CD59配体A2780细胞组细胞增殖抑制率与其他组比较,差异均有显著性(F=5.417,q=4.13、3.93,P<0.05).
　　3 讨 论
　　补体调节蛋白CD59的过表达是肿瘤细胞逃避补体溶细胞作用的重要机制[6].CD59 是一种多功能的分子, 其主要作用是与MAC中的C8 和(或)C9 结合从而抑制补体的活化.许多研究显示,肿瘤细胞中CD59的表达主要有以下特点.肿瘤细胞可以诱导血管内皮生长因子的分泌, 从而诱导肿瘤细胞表面上调CD59的表达, 增加周围基质中CD59的沉积.在某些肿瘤中一些急性炎症因子,如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6在肝癌中能上调CD59的表达[7].表达CD59的肿瘤细胞自身可以向周围基质释放一些含有锚结构可溶性的CD59,可以插入到同源细胞的胞膜上,具有补体限制作用,在肿瘤微环境中可以阻止补体及抗体等对肿瘤细胞的结合[8].
　　对肿瘤免疫的研究发现, CRP在肿瘤逃避免疫攻击中起了非常重要的作用,CD59在多种泌尿系统常见恶性肿瘤及女性生殖系统恶性肿瘤均有高表达,提示与肿瘤逃逸相关.MURRAY等[1]用免疫组织化学等方法对54例良恶性子宫内膜组织中CRP的表达进行检测,发现恶性子宫内膜组织高表达CD59,并推测这是恶性子宫内膜组织之所以能逃避补体攻击所致细胞溶解的原因,并由此间接促进其致癌作用.
　　卵巢癌的发生发展与CD59 密切相关,CD59分子的过量表达可直接导致癌细胞逃逸机体的免疫监视.因此,肿瘤免疫治疗方法是使肿瘤细胞膜上的CD59失活或不表达,如封闭细胞膜上的CD59活性位点已取得了较好的治疗效果.
　　在前期的研究中,本室采用噬菌体展示技术,筛选并合成能与人CD59分子特异结合的短肽,证实该短肽能与正常的CD59分子结合而封闭其活性位点,显著增强补体对高表达CD59分子肿瘤细胞的溶破效应,具有中和正常CD59分子活性的作用.以此为基点,我们构建CD59配体pIRES真核表达重组体并转染高表达CD59的卵巢癌A2780细胞,筛选稳定转染克隆细胞系,进行相关功能检测.证实CD59配体肽可结合并封闭其补体活性位点,中和其补体抑制活性.但 CD59配体肽基因重组后,如何影响CD59 mRNA的表达,分子在胞内的组装、折叠以及向胞膜的转运模式等机制尚在探讨之中.本研究为前列腺癌的基因靶向治疗开辟了一条新途径,具有重要理论意义及临床应用价值.
　　【参考文献】
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