【摘要】目的 检测HIF-1α与PHD2在几种皮肤恶性肿瘤中的表达,探讨两者的相关性.方法  采用免疫组织化学的方法检测18例基底细胞癌,16例纤维肉瘤,12例恶性黑色素瘤以及20例正常组织中HIF-1α及PHD2表达.结果  HIF-1α在正常组织中、皮肤基底细胞癌、纤维肉瘤及恶性黑色素瘤组织中的阳性表达率分别为12.0%、46.2%、72.8%、82.6%;PHD2在正常组织中、皮肤基底细胞癌、纤维肉瘤及恶性黑色素瘤组织中的阳性表达率分别为72.7%、85.8%、76.2%、89.1%.结论  HIF-1α的表达高低可能与肿瘤的侵袭性有关,保持PHD2对HIF-1α的正常负性调控可能是癌性组织向正常组织转归的枢纽之一.
　　【关键词】缺氧诱导因子  脯氨酸羟化酶  基底细胞癌  纤维肉瘤  恶性黑色素瘤
　　HIF-1α是缺氧诱导因子1(HIF-1)的亚单位,是一种氧依赖转录激活因子.包括能量代谢、血管新生等在内的一系列参与了肿瘤细胞的增长和转移等的重要过程均有HIF-1α介导转录的基因参与.[1] 脯氨酸羟化酶(PHD)在HIF族系的调控中有至关重要的作用,因而被认为是体内的氧感受器[2].有动物实验证实,敲除PHD2编码基因的大鼠的血管增生和扩张能力明显高于敲除PHD1和PHD3编码基因的大鼠,认为在HIF-PHDs的各亚型中,PHD2而非PHD1或PHD3是成年大鼠血管增长的一个主要负性调控因子.[3] 本实验检测了HIF-1α与PHD2在几种皮肤恶性肿瘤中的表达,探讨两者的相关性.
　　1 材料与方法
　　1.1 材料  抗HIF-1α单克隆抗体,美国Epitomics公司生产.抗PHD2单克隆抗体,英国Abd公司生产.
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 取材  实验组标本46例,包括基底细胞癌组18例,纤维肉瘤组16例,恶性黑色素瘤组12例.其中男性26例,女性20例,年龄47.50 (平均47.50±11.26)岁.全部46例皮肤恶性肿瘤组织标本来自青岛大学医学院附属医院病理科保存完好及临床资料完整的存档蜡块,病理组织学证实为皮肤恶性肿瘤,并根据临床资料排除妊娠期或哺乳期内的妇女,近半年内参加过放疗、化疗或其他形式针对肿瘤的治疗的患者,以及有血液、内分泌、或肝肾等重大疾病史的患者.对照组标本为正常皮肤组织20例,均为青岛大学医学院附属医院医学美容中心美容手术去除的多余正常皮肤.
　　1.2.2 HIF-1α与PHD2抗体检测  对照组标本制备蜡块,将全部蜡块切片,采用PV-9000二步法免疫组化染色.两位独立的观察者对每例正常组织以及皮肤肿瘤标本采用40倍物镜在3个独立的包含总计300个癌细胞的评估区域对HIF-1α和PHD2染色密度进行评定.每张切片随机选择5个200×视野,首先计数每个视野的阳性细胞率,然后计算5个视野的平均阳性细胞率,当阳性细胞占细胞总数10%以上为阳性表达.
　　1.2.3 统计学方法  采用SPSS11.5软件进行统计学分析,计量资料采用t检验,技术资料采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义.
　　2  结果
　　HIF-1α的阳性表达多位于肿瘤组织的细胞浆中,从片中着色情况来看,其在正常皮肤、皮肤基底细胞癌、皮肤纤维肉瘤及恶性黑色素瘤中的表达依次升高,分别为12.0%,46.2%,72.8%和82.6%;各组间阳性表达率比较有统计学意义(P<0.05),组间两两比较详见表3.而PHD2在正常组织以及恶性肿瘤组织切片中均有广泛表达,阳性率组间比较没有统计学意义.
　　详见表4:
　　表3 HIF-1α在正常皮肤及皮肤恶性肿瘤中的表达
　　组别                           例数    阳性表达率        P
　　正常皮肤(A)          20         12.0%          <0.05
　　基底细胞癌(B)    18         46.2%          <0.05
　　纤维肉瘤(C)         16         72.8%          <0.05
　　恶性黑色素瘤(D) 12         82.6%          <0.05
　　组间两两比较 PAB<0.05,PAC<0.05,PAD<0.05
　　PBC<0.05, PBD<0.05
　　PCD>0.05
　　表4 PHD2在正常皮肤及皮肤恶性肿瘤中的表达
　　组别                          例数   阳性表达率          P
　　正常皮肤(A)          20         72.7%          >0.05
　　基底细胞癌(B)     18         85.8%          >0.05
　　纤维肉瘤(C)         16         76.2%          >0.05
　　恶性黑色素瘤(D) 12         89.1%          >0.05
　　组间两两比较  PAB>0.05,PAC>0.05,PAD>0.05
　　PBC>0.05, PBD>0.05
　　PCD>0.05
　　3  讨论
　　由于增生异常以及血管数量有限,所有实体肿瘤内均存在不同程度的缺氧区域.在基底细胞癌等一些常见的皮肤肿瘤当中,缺氧以及血管密度降低与预后不良和放化疗抵抗密切相关.对缺氧最具有特征性的分子反应是由HIF转录因子复合物介导的.HIF-1包括HIF-1α和HIF-1β两个亚单位,作为一种氧依赖转录激活因子,HIF-1α是其中的主要活性成分.细胞氧浓度的改变对于HIF-1α的表达和活性具有严密的调控作用.在氧浓度正常的状态下,HIF-1α蛋白在合成后即被迅速降解,其降解途径是细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径.然而当细胞内缺氧时,HIF-1的表达即受到诱导,包括能量代谢、血管新生等在内的一系列参与了肿瘤细胞的增长和转移等的重要过程均有HIF-1α介导转录的基因参与[4].本试验发现HIF-1α在正常皮肤、皮肤基底细胞癌、皮肤纤维肉瘤及恶性黑色素瘤中的表达依次升高,契合了国内外的关于生长因子增高的结论,皮肤肿瘤的三个实验组与正常皮肤组两两比较均具有统计学意义,证实了HIF-1α-在皮肤恶性肿瘤的发生发展中的重大作用,而组间比较基底细胞癌与纤维肉瘤组间及基底细胞癌与恶性黑色素瘤组之间亦具有统计学意义,提示HIF-1α不仅可以作为正常组织与肿瘤组织之间判定的指标之一,还可以作为肿瘤组织恶性程度的参考指标之一,但纤维肉瘤组与恶性黑色素瘤组间比较无统计学意义,提示该两种皮肤肿瘤在缺氧状态下的HIF-1α表达及肿瘤组织的侵袭发展上具有较多的共同性.
　　在人类中,发现三种以氧作为协同底物的脯氨酸羟化酶并被命名为HIF-PHDs.在氧利用度受限时,PHD活性降低,HIF-1α降解受阻,引发大量的基因转录.由于PHD在HIF-1α的调控中有重要的作用,因而被认为是体内的氧感受器[5].本实验发现PHD2在正常组织,皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌及恶性黑色素瘤中均有表达,组间比较并无统计学意义,提示单纯PHD2的检测不能作为区分正常组织和恶性肿瘤组织的指标,对于肿瘤恶性程度的判定亦无意义.
　　PHD2对HIF-1α的正常调控很可能是控制肿瘤发生发展以及判定肿瘤组织侵袭性的重要指标之一.二者在皮肤恶性肿瘤组织中的表达相关性国内外一直鲜有报道,本实验对于二者在不同标本中的相关性尚未进行分析研究.进一步的研究可能对通过检验H IF-1α和PHD2分析其相关性,进而指导皮肤肿瘤的治疗提供一定的临床指导.
　　综上所述HIF-1α能通过多种调控机制引起肿瘤的生长发展及转移,利用HIF-1α的这一特性,HIF-PHD2调控轴可能成为治疗肿瘤的新靶点.如何通过药理学的途径激活PHD2的表达或活性来降低缺氧条件下HIF-1α的表达水平和活性,从而防治皮肤各种恶性肿瘤将是未来重点探讨的方向.
　　参 考 文 献
　　[1] Shi YH,Fang WG. Hypoxia-inducible factor-1 in tumor angiogenesis. World J Gastroenterol,2004,10 (8) : 1082 -1087.
　　[2] 聂金,缺氧诱导因子脯氨酸羟化酶的调控与缺血缺氧性疾病. 国际病理科学与临床杂志,2006,27(1):53-56.
　　[3] Amandine Ginouves,KarineIlc,Nuria Mac as,Jacques Pouyssegur and Edurne Berra.PHDs overactivation during chronic hypoxia "desensitizes" HIFα and protects cells from necrosis[J].PNAS,2008,105(12): 4745-4750.
　　[4] Leyland - Jones B. Evidence for erythropoietin as a molecular targeting agent. Semin Oncol,2002,29 (3 Suppl 11) :145~154.
　　[5] Volm M,Koomagi R. Hypoxia-inducible factor(HIF-1) and its relationship to apoptosis and proliferation in lung cancer. Anticancer Res,2000,20 (3A) :1527~1533.