【摘要】目的:研究MMP- 2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达,并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较,探讨其与宫颈癌侵袭/转移的关系.方法:应用RT-PCR的方法检测48例宫颈癌组织、正常宫颈组织及16例宫颈良性病变组织中MMP-2 的表达情况,并对数据进行分析.结果:MMP-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达率分别为64.58%、37.50%、31.25%,宫颈癌与正常宫颈组织(P=0. 012)、宫颈癌与宫颈良性病变组织(P=0. 031)间的MMP-2表达率差异有统计学意义,而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的MMP-2表达率差异无统计学意义(P=0.091).MMP-2在不同临床分(P=0.001)及淋巴结转移(P=0.002)中的表达率存在显著差异,但在不同年龄患者的癌组织中MMP-2的表达率无差异(P>0.05).结论:MMP-2在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织MMP-2与宫颈癌临床分期密切相关,临床分期越晚,其肿瘤组织中MMP - 2的表达率越高.伴淋巴结转移宫颈癌MMP - 2表达率高于无淋巴结转移者.MMP-2表达率与患者年龄无关.
　　【关键词】宫颈癌,机制金属蛋白酶-2 ,逆转录聚合酶链式反应
　　【Abstract】Objective:To study the expression of MMP-2 in human cervical cancer and explore the relationship between MMP-2expression and clinicalpathological feature(s patient's age,limph node metastasis,clinical stage,). Method:The expression of MMP-2 in 48 cases of human cervical cancer tissues,normal cervical tissues and 16 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse tranｓｃｒｉｐｔase polymerase chainreaction (RT-PCR).Results: Theexpression rate of MMP-2 in cervical cancer,normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 64.58%、37.50%、31.25%,statistical difference wasfound among cervical carcinoma group,normal cervical tissues group and benign lesion group.The expression of MMP-2were associated with clinical stage (P=0.001) and lymph node metastasis (P=0.002),but had no correlation with age and tumor size (P>0.05).Conclusion:MMP-2expression is increased in cervical cancertumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue,MMP-2 is relevant with the occurrence of cervical cancer.The cervical cancer cellsproliferation capacity is increase,degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which MMP-2 expressed.
　　【Key words】Cervical cancer,MMP-2,RT-PCR
　　基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类活性依赖金属锌离子的蛋白酶,可以有效地降解基底膜和细胞外基质(ECM),从而参与促进肿瘤生长、浸润和转移[1].基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是MMPs家族的重要一员,在多种肿瘤中存在过表达,对肿瘤的侵袭和转移起重要作用.本研究对MMP-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达进行检测,并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较,探讨其与宫颈癌侵袭转移的关系.
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源 标本均来自我院2006年10月~2009年10月期间住院手术切除标本共112例.其中宫颈良性病变组织16例(宫颈糜烂10例、宫颈息肉3例、宫颈肥大3例)、宫颈癌组织(病理证实为鳞状细胞浸润癌及宫颈腺癌)及正常宫颈组织(因子宫肌瘤行子宫全切患者)各48例.病理分级根据2006年修订的国际妇产科联盟(FIGO)宫颈癌分期,0期5例,Ⅰ期28例,II12例,Ⅲ期3例;伴淋巴结转移30例,无淋巴结转移18例;全部患者术前均未行任何抗癌治疗.所有患者均为女性,宫颈癌患者中位年龄48岁(18~77岁);宫颈良性病变患者中位年龄34岁(22~43岁).
　　1.2 组织总RNA的提取和cDNA的合成 总RNA的提取参照TRIzol试剂说明书操作,所得RNA用75%乙醇洗涤后晾干,溶于20ml DEPC水中,再经微量核苷酸定量检测仪测定RNA浓度及A 2 6 0 /A 2 8 0, 琼脂糖凝胶电泳检测R NA质量,选取A260/A280比值为1.8-2.0的RNA进行反转,所得的cDNA产物在-20℃保存,用于下一步PCR.
　　1.3 逆转录反应 在20μl的反应体系中加入5×reactionbuffer4μl,olig(o dT)18Prime(r 0.5μg/μl)1μl,RiboLock TMRibonuclease inhibitor(20U/μl)1μl,10mM dNTP 2μl,总RNA2μg,逆转录酶M-MLV1μl,DEPC水补齐至20μl,42℃孵育60min(逆转录),72℃孵育10min以终止反应,于冰上降温(灭活逆转录酶).
　　1.4 PCR反应 扩增MMP-2基因的引物序列,上游引物ACTTTGGCCGCTGGGAGCAT,下游引物:GGCGCTGGTGCAGCTCTCAT,扩增产物长度410bp,β-actin为内参照,上引物:CAACTTCATCCACGTTCACC,下游引物:GAAGAGCCAAGGACAGGTAC,扩增产物长度268bp.25μl的反应体中加入cDNA2μl,LOX上、下游引物各1μl,PCR Master Mx12.5μl,去离子水8.5μl混匀后,置于PCR仪中,反应条件:95℃预变性10min后,95℃30s,61℃30s,72℃30s,40个循环,最后72℃延伸10min.
　　1.5 PCR产物鉴定 用1.0%琼脂糖凝胶将提取的RNA进行电泳,在紫外线灯下观察.
　　1.6 统计分析 计数资料采用c2检验及四表格确切概率法,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理.
　　2 结果
　　2.1 MMP-2在宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达MMP-2在宫颈癌组织中的表达率为64.58%,而在正常宫颈组织和宫颈良性病变组织中的表达率分别为37.50%、31.25%.统计学分析,宫颈癌与正常宫颈组织(P=0.012)、宫颈癌与宫颈良性病变组织(P=0.031)间的MMP-2表达率差异有统计学意义,而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的MMP-2表达率差异无统计学意义(P=0.091).见表1.2.2 MMP-2与临床病理特征的关系0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期宫颈癌MMP-2表达率分别为40.00%、39.29%、100.00%、100.00%,统计学分析,Ⅱ、Ⅲ期宫颈癌MMP-2的表达率明显高于0、Ⅰ期(P=0.001);伴淋巴结转移宫颈癌MMP-2表达率为80.00%,明显于无淋巴结转移的33.33%(P=0.002);在18~50岁、>50岁的患者中MMP-2的表达率分别为60.60%、73.33%,差异无统计学意义(P>0.05).见表2.
　　3 讨论
　　宫颈癌侵袭转移是其重要的生物学行为,是导致患者死亡的主要原因.肿瘤的转移和浸润都需要降解其周围的基质和基底膜[2],使肿瘤细胞能够有更多的活动空间及进入周围组织的通道.肿瘤周围的细胞外基质和基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原和明胶,是金属基质蛋白酶的主要作用底物,至今[3],已经有20多种不同的MMPs被克隆,其中MMP-2是其中作用较强的一种,也被认为是与肿瘤关系最为密的一种.MMP-2在体内以72-kDa的非活化形式分泌,在膜型金属基质蛋白酶(MTI-MMP)的作用下转化为67-kDa的活化形式,降解Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘蛋白[4].MMP-2几乎对细胞外所有的基质成分都有一定的降解作用.大量研究表明,在多种恶性肿瘤组织中存在MMP-2的过度表达.YOSHINO等[5]研究结果显示,黑色素瘤病人血清中MMP-2的含量高于正常对照组.LANGENSKIOLD等[6]研究结果显示,直肠癌病人血浆MMP-1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均升高,认为血浆MMP-2水平可作为肿瘤恶性程度的一个相关指标.HPV是宫颈癌发生的重要病因,SMOLAHESS等[7]发现HPV阳性宫颈癌细胞系中有MTI-MMP的表达,过度表达的MTIMMP通过活化MMP-2与宫颈癌细胞的侵袭性高度相关.在本研究中,MMP-2在正常宫颈组织及宫颈良性病变组织的表达率分别为37.50%、31.25%,且差异均无统计学意义,提示MMP-2在宫颈良性病变的发生中作用并不十分明显.而在宫颈癌中MMP-2高达64.58%,高于正常宫颈组织及良性病变组织,表明MMP-2的过度表达与宫颈癌的发生有关.HIF-1在不同临床分期患者中的表达不完全相同,Ⅱ期、Ⅲ期宫颈癌患者癌组织中的表达率较0期、Ⅰ期患者升高.该实验结果反映出MMP-2表达的变化趋势,即随着宫颈癌病情的进展,MMP-2的表达率呈上升趋势.在伴有淋巴结转移的患者中MMP-2的表达率明显高于无淋巴结转移患者,提示MMP-2可能与宫颈癌发生淋巴结转移有关.而MMP-2在不同年龄组的宫颈癌患者中的表达率在统计学上无显著差异(P>0.05),表明MMP-2与患者年龄无关.以上研究表明MMP-2与宫颈癌的生存率有关.MMP-2高表达者TNM分期晚,分化低,并易出现淋巴结转移,提示MMP-2可以作为判断宫颈癌恶性类型的有用指标.MMP-2表达率与患者年龄无关.
　　参考文献
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