从生猪中分离小肠结肠炎耶尔森菌病原学研究
　　摘 要:目的 了解河南省登封市生猪中小肠结肠炎耶尔森菌的病原学特征.方法 以采集的1 346份猪咽拭子所分离的331株小肠结肠炎耶尔森菌为研究对象,进行系统生化鉴定、血清学分型和毒力基因PCR检测.结果 采集的1 346份猪咽拭子中共筛查、分离出小肠结肠炎耶尔森菌331株,分离率为24.59%(331/1 346),鉴定出O∶3、O∶5、O∶83种血清型(84.6%,2.1% 和1.8%)和1A、3、4共3个生物型,毒力基因分布特征为ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+ 占80.67%(267/331),ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF- 占3.32%(11/331)且均为血清型O∶3,其它型的为16.01%(53/331).结论 生猪为携带小肠结肠炎耶尔森菌的主要宿主,且多携带致病性菌株,提示在今后疫情控制中应加强生猪的监测、检疫和管理.
　　关键词:小肠结肠炎耶尔森菌,生猪,血清学分型,毒力因子
　　小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)广泛分布于自然界多种动物,家畜家禽带菌率较高.
　　人类与受感染的家禽家畜接触,或动物粪便污染水源、食品,均可造成散发感染甚至疫情暴发.20世纪80年代曾发生2次暴发流行,造成500余人感染[1].由于该菌嗜冷性的特点,冰箱保存的肉类及肉制品也可能成为传染源,造成小肠结肠炎耶尔森菌病的食源性传播.为了研究本地区猪咽拭子(扁桃体)携带小肠结肠炎耶尔森菌情况,根据实际工作经验,春秋两季在我省登封市生猪屠宰场采集猪咽拭子进行该病原菌的分离,并对分离到的菌株进行生化鉴定、生物分型、血清分型和毒力基因的检测,分析我省生猪携带该菌的病原学特征,为小肠结肠炎耶尔森菌感染性腹泻病的预防控制工作提供依据.
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源 2011年采集河南省登封市生猪屠宰场猪的咽拭子1 346份,屠宰场生猪来源于登封市周边农户散养.
　　1.2 试剂与仪器 耶尔森菌选择性培养基及配套抗生素为美国BD公司产品,0.1mol/L磷酸盐缓冲盐水(pH7.4,改良PBS)、克氏双糖铁琼脂(KIA)、动力吲哚尿素培养基(MIU)均购自上海CDC,哥伦比亚营养琼脂购自英国Oxoid公司.小肠结肠炎耶尔森菌分型血清购自日本生研株式会社(包括O∶1,2;O∶3;O∶5;O∶8;O∶9),菌株鉴定用API20E生化板条及配套试剂均系购自法国生物梅里埃公司,PCR扩增相关试剂及引物合成来自上海生工,PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像仪均为美国Bio-Bad公司产品.
　　1.3 菌株分离培养 将采集的标本接种于10mL改良PBS中,4℃冷增菌,分别于第7、14、21d接种耶尔森菌选择性培养基,25℃培养24~36h,挑取疑似菌落转种克氏双糖斜面25℃培养24h,选择克氏双糖+/+、不产气25H2S-,接种于尿素培养基及半固体培养基,选择尿素酶+、25℃培养动力+、37℃培养动力-,镜检为革兰阴性杆菌或椭或球杆菌细菌者,使用API 20E 生化板条做系统生化鉴定.
　　1.4 生物分型 参照文献[2]的生物分型方法进行.
　　1.5 血清学分型 生化鉴定为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株进行血清学分型,并设盐水对照.
　　1.6 DNA模板制备 使用天根细菌DNA抽提试剂盒提取DNA.具体操作按说明书进行.
　　1.7 毒力相关基因检测 PCR[3]检测小肠结肠炎耶尔森菌粘附侵袭点基因(ail)、耐热性肠毒素基因(ystA)、生物1A 型携带的肠毒素基因(ystB)、粘附素(yadA)、yop调节子转录活化作用因子(virF).
　　PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离(170V,30min).引物序列见表
　　1.  2 结 果
　　2.1 标本检出情况 1 346份生猪咽拭子中共分离出331 株小肠结肠炎耶尔森菌,检出率为24.59%.
　　2.2 生物分型及血清学分型结果 331株小肠结肠炎耶尔森菌经API20E生化鉴定板条鉴定与生物分型主要分为3个生物型:1A型、3型和4型;由于日本生研的血清类型有限,331株小肠结肠炎耶尔森菌中只能鉴定出O∶3、O∶5、O∶8这3种血清型(部分菌株与所分型血清均未发生凝集反应,暂定为血清未确定株),其所占比例分别为84.6%(280/331)、2.1%(7/331)、1.8%(38/331);其中血清型O∶3均为生物3、4型.结果见表2.
　　2.3 毒力基因检测结果 对331株分离的菌株进行ail、ystA、ystB、yadA和virF 5种毒力基因检测,结果见表3.其毒力基因分布特征为:ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+ 占80.67%(267/331),ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF- 占3.32℅(11/331)且均为血清型O∶3;其它型的占16.01%(53/331).3 讨 论有研究表明小肠结肠炎耶尔森菌在猪中尤其是猪咽拭子中小肠结肠炎耶尔森菌分离率较高[4],本次试验用无菌棉签采集生猪屠宰场猪扁桃体为研究对象,进行病原学分析.对1 346份生猪咽拭子分离培养结果显示:血清型主要以O∶3 居多,占84.59%(280/331),均为生物3型和4型;未确定血清型的菌株大多为1A型.目前研究认为,小肠结肠炎耶尔森菌根据生化反应可分为6个生物型:
　　1A、1B、2、3、4、5型,生物1A 型菌株均属于非致病型,而生物1B、2、3、4、5型中大多数为致病性菌株[5],我们结果与国内其它报道基本一致[5-6].
　　目前认为小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因主要包括:位于染色体上的毒力基因ail、ystA;位于质粒上的基因yadA 和virF,后者是小肠结肠炎耶尔森菌致病所必须的.ystB编码一种类似于YstA的耐热性肠毒素,它仅存在于生物1A型的菌株中,不具备感染特征.小肠结肠炎耶尔森菌的致病力主要与分布在染色体和70kb质粒编码的毒力因子有关,并且只有在染色体和质粒编码的各种致病因子协同作用下,才能使菌株突破宿主免疫,造成感染[7].通过PCR方法对所分离菌株进行检测,我们发现主要血清型O∶3 菌株的毒力基因是ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+,而ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF- 是O∶3血清型毒力菌株丢失质粒的结果.同时其它基因型,很可能不致病或者致病能力弱.大量实验证明,致病性耶尔森菌遗传背景复杂,染色体DNA 指纹分析具有多态性[8],因此区分有无致病性,不仅需要PCR技术,而且还需要生化鉴定、血清凝集实验等辅佐.值得关注的是,O∶8血清型在国外的分离株都是致病性菌株〔6〕,而我们分离到的菌株却都是1A型,且缺乏毒力因子.
　　生猪咽拭子分离的小肠结肠炎耶尔森菌中83.99%(278/331)为致病性菌株,也进一步证实猪是小肠结肠炎耶尔森菌致病菌株的最主要宿主.我国的养猪农户比例非常大,并且多是传统的家庭式圈养,卫生条件较差.猪-人传播在我国确实存在很大的可能性,因此,作者认为,加强猪中小肠结肠炎耶尔森菌产毒菌株携带率的监测,将成为预防和控制本病的关键所在.