福建省福氏志贺菌4c亚型的分子特征分析
　　摘 要:目的 分析福建省新出现的福氏志贺菌4c血清亚型的毒力基因分布,菌株间的遗传关联度以及基因组的多态性.方法 运用PCR扩增技术对17株F4c菌进行ipaH、set1(set1A 和set1B)、sen、ial 4种毒力基因的检测,同时运用脉冲肠凝胶电泳(PFGE)技术进行分子分型.结果 ipaH、set1(set1A 和set1B)、sen 、ial基因阳性的菌株分别占100%、94.12%、82.35%、88.23%,17株F4c菌分为I-IV型不同的毒力基因分布模式,I型是优势模式占76.47%,按100%的相似度,PFGE有12种型别(P1-P12),不存在集中优势的PFGE型别,根据TENOVER原则,分为3个PFGE群(G1-G3),G1是优势群,占64.71%.结论 我省分离的F4c血清亚型的志贺菌大部分菌株具有较强的毒力特征,绝大多数感染患者之间无明显的传播关系,不同克隆群在传播中存在着集中趋势,提示某一克隆群的F4c菌有可能逐步演变成为我省主要且稳定的福氏志贺菌流行菌株.
　　关键词:志贺菌属,4c血清亚型,分子特征
　　细菌性痢疾(菌痢)是由志贺菌属感染引起的一种常见肠道传染病.根据抗原构造不同,志贺菌属分为4个群,分别为A群(痢疾志贺菌)、B群(福氏志贺菌)、C群(鲍氏志贺菌)、D群(宋内志贺菌),其中福氏志贺菌有6个血清型以及14个血清亚型[1].
　　2005年福建省在菌痢病原监测期间首次检出福氏志贺菌4c血清亚型(F4c),且在随后的分离株中发现F4c亚型成为福建省福氏志贺菌分离株的优势血清型,继往流行的福氏2a、1b血清亚型分离的菌株数却减少[2],说明福建省福氏志贺菌优势血清型别在发生更替.为进一步了解新出现的血清亚型F4c的病原学特征,我们对2005-2010年监测中收集到的17株F4c志贺菌进行毒力基因及分子分型的研究,以期了解该血清型别菌株毒力基因流行模式、潜在的致病力以及存在的基因型别等病原学特征,为菌痢防控工作提供实验研究数据.
　　1 材料与方法
　　1.1 实验用菌株 2005-2010年福建省菌痢监测点腹泻病人中分离,经过生化和血清学复核鉴定为B群志贺菌属4c血清型的17株菌株,均为本中心细菌科保存.
　　1.2 引物引物序列及相应的扩增条件依据文献[1,3],寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.
　　1.3 PCR反应条件 PCR反应均采用20μL的反应体系,各组成成分的终浓度分别为:Ex Taq DNA聚合酶0.5U,dNTP 200μmol/L,上游引物0.4μmol/L,下游引物0.4μmol/L,DNA模板2μL.
　　1.4 模板的制备 分纯的细菌菌落,直接刮取适量于300μL的纯水制备成菌悬液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min离心5min,取上清做为PCR检测的DNA模板.
　　1.5 PFGE实验方法 根据PulseNet USA(美国CDC)网络实验室推荐的标准方法在国家CDC实验优化条件的基础上进行PFGE实验[4],采用NotI限制性内切酶对实验菌株进行酶切,标准菌株H9812采用XbaI限制性内切酶进行酶切,主要的实验参数为电压梯度6V/cm,电泳夹角120°,电泳温度14℃.电泳参数:5s~35s,17.5h.
　　1.6 数据分析 PFGE 图像导入BioNumerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)软件包进行处理,选择Dice相关系数和UPGMA 方法,tolerance设置为1.5%.
　　1.7 试剂仪器 Taq DNA 聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司,琼脂糖为BioAsia分装品,Seakem Gold Agarose PFGE 级琼脂糖购自Lonza公司,XbaⅠ和NotⅠ限制性内切酶以及蛋白酶K购自美国NEB公司,BIO-RAD公司的Basic电泳仪、Gel Doc XR+读胶仪、CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪,PCR 扩增仪为G-Storm(英国GenenTech公司),BioMérieux Vitek公司的DENSIMAT细菌浊度仪.
　　2 结 果
　　2.1 志贺菌毒力基因检测结果 17株F4c菌经PCR扩增相关的毒力基因,结果显示ipaH 基因阳性菌株占17/17(100%),set1(set1A、set1B)基因阳性菌株占16/17(94.12%),sen基因阳性菌株占14/17 (82.35% ),ial 基因阳性菌株占15/17(88.23%).
　　2.2 毒力基因携带模式 17株F4c菌按4种毒力因子分布的不同特征分为4种不同的毒力基因分布模式,命名为I-IV 型,I型和II型的菌株数分别占13/17(76.47%)、2/17(11.76%),III型和IV 菌株数均占1/17(5.88%),见表1.2.3 PFGE分子分型结果 17株F4c菌用NotⅠ酶切并进行脉冲场电泳后,可见大小不一的电泳条带,分子量从31.48~1 450kb,菌株条带数目在15~18之间.利用BioNumerics软件的Cluster analysis模块进行聚类分析,菌株间条带相似度在59.4%~100%之间;按照100%的相似度可将菌株酶切图谱分为12种PFGE型别,命名为P1-P12,其中P1 型占3/17(17.65%),P3 和P12 占2/17(11.76%),P2、P4、P6-P11型均占1/17(5.88%);大于91.6%相似度的聚类结果显示各组菌株间均只有1~3条带数的差异,根据TENOVER原则[5],1~3条带差异的菌株可能有紧密相关性,因此17株F4C血清亚型菌株可分为3个群命名为G1-G3,其中G1占11/17、G2占4/17,G3占2/17,G1和G2的相似度为81.7%,G3和G1、G2的相似度为59.4%,具体见图1.
　　2.4 PFGE型别不同年代的分布情况 17株F4c菌G1-G3群PFGE分子分型不同年代分布结果,见表2.
　　3 讨 论
　　福氏志贺菌4c亚型原先是一种较少见的血清型,国际上较早报道的国家有罗马尼亚(1960s)、日本(1980s)、前苏联(1980s)等国家[6-8].我国关于此血清型别的报道见于2000年后,广东、江苏、深圳、马鞍山市[9-12]等多个地市均陆续报道分离出该亚型细菌,同时呈上升的趋势.福建省于2005年首次分离到该血清亚型,随后2005-2010年在菌痢监测中共分离到福氏志贺菌40株,F4c血清亚型17株,占17/40(42.5%),也是我省B群志贺菌的优势流行血清型别,同全国大部份省份的F4c血清亚型的变迁情况相似.
　　目前PCR扩增检测志贺菌毒力相关的主要因子有:侵袭性质粒抗原(ipaH)、侵袭性相关位点(ial)、志贺菌肠毒素1(ShET-1)编码基因set1(set1A 和set1B)、志贺菌肠毒素2(ShET-2)编码基因sen[3,13-15].结果ipaH 、set1(set1A、set1B)、sen、ial基因阳性的F4c菌株分别占17/17(100%),16/17(94.12%),14/17          (82.35%),15/17(88.23%);4种毒力基因全阳性菌株(I 型)占13 /17(76.47%),以上实验数据同国内相关省份的报道相似[10,12].毒力基因检测情况说明目前在我省分离的大部分F4c血清亚型的志贺菌,具有较强的毒力特征,即有相对较强的致病力,易于成为菌痢暴发流行的菌株,应该引起重视,加强病原菌的监测.
　　从血清表型来看F4c志贺菌已经成为我省菌痢分离株的主要组成部分,但PFGE分子分型的结果显示:按照100%的相似度17株菌株酶切图谱分为12种PFGE型别,并没有集中优势的基因型别,侧面说明大多数感染患者之间无明显的传播依据,属于散发的病例;但是根据TENOVER原则分成的G1-G3群却存在着集中趋势,G1 群占11/17(64.71%),且从年代分布来看G1群是2007年后主要的PFGE群,由于群间的菌株存在着紧密相关性,说明3个PFGE群可能是来源于3组不同克隆群的分化菌株,散在发生的菌株在遗传上有相关性;以上情况同时说明正在变迁进化中的F4c克隆群菌株在流行传播中存在着基因变异现象,形成基因组流行形式的多样性,同时不同克隆群在传播中却存在着克隆群优势集中趋势,提示某一克隆群的F4c菌有可能逐步演变成为我省主要且稳定的福氏志贺菌流行菌株.