【摘要】  目的 研究西罗莫司对氯化钴(CoCl2)诱导的肝癌HepG2细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响.方法 用CoCl2诱导细胞模拟缺氧微环境,并根据CoCl2浓度不同分为0、50、100、200及400 μmol/L组;选择CoCl2浓度为200 μmol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境,同时分别联合0、10、20、30、40 nmol/L的西罗莫司作用于细胞24 h.应用逆转录-聚合酶链反应检测HIF-1α mRNA的表达.结果 随CoCl2浓度提高,HIF-1α mRNA的表达升高(F=103.67,q=4.83~24.15,P<0.05),其中CoCl2浓度为200和400 μmol/L两组比较差异无显著性(q=0.69,P>0.05);西罗莫司可使HepG2细胞HIF-1α mRNA的表达降低并呈剂量依赖性(F=127.90,q=4.24~28.28,P<0.05).结论 缺氧微环境可以促进HepG2细胞中HIF-1α mRNA的表达,HIF-1α可能通过在细胞缺氧调控中起作用而参与了肿瘤的发生发展.西罗莫司可以抑制HIF-1α mRNA的表达,这可能是其抗肿瘤的机制之一.
　　【关键词】  肝肿瘤;HepG2细胞;西罗莫司;缺氧诱导因子1,α亚基
　　[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of sirolimus on the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells induced by cobalt chloride.Methods Cobalt chloride was used to mimic the cell hypoxic microenvironment, and HepG2 cells were divided into five groups according to different concentrations of cobalt chloride, i.e. 0-, 50-, 100-, 200-, and400 μmol/L groups. The concentration of 200 μmol/L of cobalt chloride was chosen to mimic tumor hypoxic microenvironment, and, at the same time, different concentrations of sirolimus (0, 10, 20, 30, and 40 nmol/L) were applied to treat the cells for 24 h. The expression of HIF-1α mRNA was detected by semi-quantitative reverse tranｓｃｒｉｐｔion-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results With increasing of concentration of cobalt chloride, the expression of HIF-1α mRNA increased(F=103.67,q=4.83-24.15,P<0.05), and there was no significant difference between 200 μmol/L group and 400 μmol/L group. The expression of HIF-1α mRNA of HepG2 cells induced by cobalt chloride was degressive with the effect of sirolimus, and became dose-dependent (F=127.90,q=4.24-28.28,P<0.05). Conclusion The expression of HIF-1α mRNA of HepG2 cells can be elevated by hypoxic microenvironment, and HIF-1α may play an important role in the cell hypoxic regulation to participate in the tumorous growth. Sirolimus can inhibit the expression of HIF-1α mRNA, which may be one of its antineoplastic mechanisms.
　　[KEY WORDS]Tumor of liver; HepG2 cell; Sirolimus; Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit
　　由于肿瘤细胞的失控性生长导致耗氧量的增加,缺氧成为肿瘤细胞生长的基本环境,肿瘤细胞如何适应这一微环境并保持持续生长已成为肿瘤研究的中心问题.缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,由HIF-1α和HIF-1β亚基组成,HIF-1α是惟一的氧调节亚单位,决定HIF-1的活性[1],而HIF-1直接调控VEGF基因的表达,是恶性肿瘤诱导新生血管形成的主要调控因子.西罗莫司(SRL)是从吸水性链霉菌发酵液中提取出的一种大环内酯类抗生素,研究显示SRL不仅有抗移植免疫排斥反应作用,而且还有广泛的抗肿瘤作用[2,3].本文用氯化钴(CoCl2)化学模拟诱导肝癌HepG2细胞内缺氧,再加不同浓度SRL培养,观察细胞内HIF-1α表达变化,并对其发生机制进行初步研究.
　　1 材料与方法
　　1.1  材料
　　RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清为美国Gibco公司产品;SRL为Sigma公司产品;Trizol试剂盒购自Introvigen公司;RT-PCR试剂盒购自美国Promege公司;引物及GAPDH内参由上海生工生物工程公司提供.
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养
　　人肝癌HepG2细胞由南京凯基生物科技有限公司提供.将肝癌HepG2细胞接种于含体积分数为0.10的胎牛血清的1640培养基,内含100 U/L青链霉素,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、正常氧浓度与饱和湿度的培养箱中培养,进入对数生长期后,传代于6孔细胞培养板中,选择生长良好的肝癌细胞用于实验.
　　1.2.2 实验分组
　　对照组用培养液培养48 h,实验组用培养液培养24 h后,用含不同浓度CoCl2的培养液处理细胞24 h,根据CoCl2浓度不同分为5个亚组(0、50、100、200和400 μmol/L组); 选择CoCl2浓度为200 μmol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境,用培养液培养细胞24 h后,对照组用200 μmol/L的CoCl2培养液培养24 h,实验组用含SRL分别为0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl2培养液培养24 h.
　　1.2.3  RT-PCR
　　TRIZOL法提取6孔板内各组细胞的总RNA,紫外线分光光度计测定总RNA浓度,重复测定3次,-70 ℃冰箱保存.各样本取1 μg总RNA,按Promege一步法使用说明书进行RT-PCR;所用引物由上海生物工程技术有限公司合成:HIF-1α上游引物序列为5′-ACGTGTTATCTGTCGCTTTG-3′,下游引物序列为5′-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′,目的片段长度为371 bp;内参照基因GAPDH的上游引物序列为5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′,下游引物序列为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′,目的片段长度为146 bp.RT-PCR反应条件:45 ℃逆转录45 min,94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,64 ℃退火1 min,68 ℃延伸2 min,27次循环后68 ℃终末延伸7 min.取出5 μL PCR 产物,加1 μL Loadingbuffer,反复吸打混匀后,于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳,电流为10 mA,电源120 V,电泳30 min,长波紫外线下观察电泳条带情况并照相,GIS凝胶成像处理系统成像,并进行吸光度定量分析.PCR 产物相对量=扩增产物的吸光度值/GAPDH 扩增产物的吸光度值.阳性结果为HIF-1α的RT-PCR产物电泳后在紫外线灯照射下出现371 bp的荧光条带.
　　1.2.4  统计学处理
　　采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[4]统计分析软件对数据进行统计学处理,组间比较采用单因素方差分析.
　　2 结 果
　　2.1 不同剂量CoCl2对肝癌HepG2细胞中HIF-1α mRNA表达的影响
　　HIF-1α mRNA在0、50、100、200和400 μmol/L的CoCl2处理组表达强度分别为0.79±0.04、0.94±0.03、1.06±0.02、1.14±0.02、1.13±0.03,随着CoCl2的浓度的升高HIF-1α mRNA表达增强(F=103.67,q=4.83~24.15,P<0.05),其中CoCl2浓度为200和400 μmol/L两组比较差异无显著性(q=0.69,P>0.05).RT-PCR产物的电泳结果见图1.
　　2.2 不同剂量的SRL对肝癌HepG2细胞中HIF-1α mRNA表达的影响
　　HIF-1α mRNA在含SRL分别为0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl2培养液处理组中的表达强度分别为1.10±0.03、1.04±0.02、0.95±0.03、0.84±0.03、0.70±0.03,随着SRL浓度的升高HIF-1α mRNA的表达减弱(F=127.90,q=4.24~28.28,P<0.05).RT-PCR 产物的电泳结果见图2.
　　3 讨 论
　　肝细胞癌恶性程度高,进展迅速,术后易复发和转移,目前尚缺乏有效的治疗药物.肝细胞癌为典型的多血管肿瘤,抗血管生成在其治疗中有着诱人的前景[5].缺氧诱导因子HIF-1最先由WANG等[6]在研究低氧诱导的基因表达时发现,它是在缺氧条件下广泛存在于人体内,由HIF-1α和HIF-1β亚基组成异源二聚体的转录因子,其中HIF-1α是主要活性单位,其表达受氧分压调节.HIF-1α感受缺氧信号后,自身被迅速激活,进入核内与其他转录因子协同作用并结合到缺氧相关基因的调控元件,调控相关基因的表达,以维持细胞和机体的氧自稳平衡及能量代谢平衡.而缺氧是实质性肿瘤物理微环境之一,所以HIF-1α对于肿瘤的生长尤为重要.鉴于此点,我们选择HIF-1α为研究指标,探讨SRL抗肿瘤作用的可能机制.
　　本研究利用在培养液中加入CoCl2的方法模拟细胞缺氧环境,这里CoCl2的作用与低氧一致,Co2+是亚铁螯合酶的底物,可取代细胞中的Fe2+与血红素结合,使原卟啉Ⅸ与O2分子的结合能力下降,阻断O2信号的传递,导致细胞内环境处于乏氧状态,诱导HIF-1α的表达.同时,Co2+还能通过替代作为脯氨酰羟化酶(PHD)辅助因子的Fe2+,抑制PHD对HIF-1α的羟基化作用,减少HIF-1α的降解[7].本研究结果显示,利用低浓度的CoCl2预处理细胞,HIF-1α的表达随着缺氧程度的增高而增强,提示无论在常氧还是低氧条件下,HIF-1α在肝癌HepG2细胞均中有表达,且随着CoCl2浓度的增高,即缺氧信号的加强(实质性肿瘤发展越快,氧供的不平衡就越明显),其mRNA表达水平上调.其可能的机制为:当氧需求量绝对或相对增加,肿瘤细胞可通过启动缺氧应答的开关"HIF-1",使其表达上调,最终启动一系列下游基因转录,其产物使肿瘤细胞适应缺氧的应激状态继续存活和增殖.
　　SRL是一种大环内酯类化合物,具有抗真菌和增强免疫抑制活性的作用,目前作为免疫抑制剂广泛应用于临床.最近研究结果显示,SRL具有广泛的抗肿瘤作用,如抗胰腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、肾癌等.研究表明,在低氧环境激活HIF-1α的过程中,mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途径起了进一步放大效应[8].以往研究显示,抑制mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途径对实体肿瘤,特别是恶性程度高或对化疗耐药的肿瘤,具有治疗意义[9].SRL通过特异性抑制mTOR而抑制HIF-1α的激活,可有效下调HIF-1α基因的表达,既能抑制HIF-1α基因的合成,又能增加其降解,并能下调HIF-1α基因调控的其他基因的表达[10].
　　本实验结果显示,SRL能明显使肝癌HepG2细胞HIF-1α mRNA表达下降,且随着SRL浓度的升高,HIF-1α mRNA的表达也越来越低.由此推测,SRL可以通过上述信号途径,阻断HepG2细胞表达HIF-1α mRNA,进而抑制其下游基因VEGF的表达,从而抑制肿瘤的发生发展,这可能是其抗肿瘤的机制之一.
　　总之,近年来抗肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗的基础和临床研究热点,是最有希望的肿瘤导向治疗靶标.尤其是研制以HIF-1为治疗靶点的肿瘤治疗药物,已成为抗肿瘤治疗研究的热点,通过抑制HIF-1α蛋白表达来抑制受其调控的多种促肿瘤生长相关基因的表达水平,从多方面入手抑制肿瘤的发生和发展.本研究通过对SRL抑制人肝癌HepG2细胞中HIF-1α表达的研究,进一步揭示其抗肿瘤血管生成的作用机制,为开发抗肿瘤血管生成新药奠定理论基础,为临床应用提供理论依据.
　　【参考文献】
　　1]GASSMANN M, CHILOV D, WENGER R H. Regulation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha ARNT is not necessary for hypoxic induction of HIF-1 alpha in the nucleus[J]. Adv Exp Med Biol, 2000,475:87-99.
　　[2]STEPHAN S, DATTA, WANG E, et al. Effect of rapamycin alone and in combination with antiangiogenesis therapy in an orthotopic model of human pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004,10:6993-7000.
　　[3]DANIEL J, BOFFA, FULUNG L, et al. Rapamycin inhibits the growth and metastatic progression of non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004,10:293-300.
　　[4]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):29-32.
　　[5]侯继院,沈方臻,王延涛,等. 顺铂低剂量节律化疗抑制小鼠H22肝癌血管生成观察[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(2):59-62.
　　[6]WANG G L, SEMENZA G L. Character-aterization of hypoxia-inducible factor-1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia[J]. J Biol Chem, 1993,268:21513.
　　[7]吕国蔚. 低氧适应的进化[J]. 首都医科大学学报, 2002,23(2):185.
　　[8]JIANG B H, JIANG G, ZHENG J Z, et al. Phosphatidylino-sitol 3-kinase signaling controls levels of hypoxia-inducible factor 1[J]. Cell Growth Differ, 2001,12:363-369.
　　[9]HU L, HOFMANN J, LU Y, et al. Inhibition of phosphatidylinositol 3′-kinase increases efficacy of paclitaxel in in vitro and in vivo ovarian cancer models[J]. Cancer Res, 2002,62(4):1087-1092.
　　[10]BRUGAROLAS J B, VAZQUEZ F, REDDY A, et al. TSC2 regulates VEGF through mTOR-dependent and independent pathways[J]. Cancer Cell, 2003,4:147-158.