【摘要】  目的 研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性.方法 取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418 筛选稳定表达细胞克隆;酶免疫法及RTPCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达;制备抗CD59多克隆抗体,MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性.结果野生型及突变型CD59质粒扩增成功,并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株;与野生型CD59 相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异.结论 CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,有望应用于肿瘤治疗.
　　【关键词】  抗原,CD59;卵巢肿瘤;基因;突变
　　[ABSTRACT] Objective To study the anticomplementary activity (ACA) of widetype CD59 and mutant CD59 on ovarian cancer A2780 cells.  Methods The piresWTCD59 plasmid and the piresM1CD59 plasmid were transfected into A2780 cells. Stable expression clones were selected by the addition of G418. Immunohistochemistry method and RTPCR were used to analyze the quantity of protein CD59. The ACA of CD59 was tested by MTT method.  Results The piresWTCD59 plasmid and the piresM1CD59 plasmid were successfully amplified. A2780 cells with piresWTCD59 and cells with M1CD59 were selected. The results suggested that mutant CD59 lost its protection of being against human complement compared with WTCD59. There was no significant difference compared with CD59 on A2780 cells.  Conclusion The W40 of human CD59 is important to its activity, prohibition of this site may be a potential way to raise complement activity and treat tumor.
　　[KEY WORDS] Antigen, CD59; Ovarian neoplasms; Gene; Mutation
　　CD59 是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固糖蛋白,具有多种重要的免疫功能[1].首先,它作为补体系统终末阶段的调节蛋白,以同源限制的方式,与C8和(或)C9结合从而抑制攻膜复合物MAC的生成,保护自身正常组织细胞免受补体损伤.其次,GPI  锚固的CD59是一个重要的信号转导分子,参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T 细胞的活化信号转导过程,尤其是作为CD2的配体在T 细胞活化中的辅助作用倍受人们的关注.近年来,国外报道已在多种实体肿瘤细胞中,如卵巢、前列腺等发现有CD59分子的过表达,并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关,提示CD59分子的抗补体活性可能与生殖系统肿瘤细胞的逃逸相关[2].CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点.CD59分子NMR 结构显示,抗补体活性区域主要集中于N37~H44 之间,推测 CD59第40 位保守氨基酸可能是CD59分子活性位点[3].本研究拟用基因转染的方法,将野生型CD59基因及其突变体(40位色氨酸缺失)转染入人卵巢癌细胞A2780中,观察转染后A2780细胞生长状态及40位色氨酸缺失后CD59分子抗补体活性的改变.
　　1       材料和方法
　　1.1       材料
　　1.1.1       质粒、菌株与细胞株       人突变CD59 cDNA重组PIRES载体(piresM1CD59),其含有一段约500 bp的CD59突变基因,即CD59第40位点色氨酸缺失;野生型CD59 cDNA重组PIRES载体(piresWTCD59),含有一段约500 bp的正常CD59基因,均由本室构建并保存.大肠杆菌JM109由本室保存;卵巢癌细胞A2780由齐鲁医院惠赠.
　　1.1.2       主要试剂       RPMI 1640 培养基购自Gibco公司;牛血清购自杭州四季青公司;胰酶和G418均购自Amresco公司;真核表达载体PIRES含有CMV强启动子序列,购自TakaRa公司.限制性内切酶EcoR Ⅰ购自TakaRa 公司;转染试剂Lipofectin Reagent购自 Invitrogen公司;MTT由中国医学科学院血液研究所提供;鼠抗人CD59单克隆抗体购自BD公司;RTPCR试剂盒与总RNA提取试剂Biozol均购自Promega公司.
　　1.2       实验方法
　　1.2.1       质粒的扩增及鉴定       将本室保存的两种重组质粒转化大肠杆菌JM109.碱裂解法小量提取质粒,EcoRⅠ37 ℃过夜酶切,同时设PIRES空质粒作为阴性对照,酶切产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,以DNA标准相对分子质量为参照,筛选含重组基因的转化子.阳性克隆ALB扩增菌液划板备用.
　　1.2.2       细胞转染及稳定转染细胞系的建立       转染试剂为阳离子脂质体Lipofectin Reagent.在转染前1 d,用2.5 g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞,取0.5 mL加入24孔细胞培养板中37 ℃过夜培养24 h,细胞达到80%~90% 融合.取piresWTCD59及piresM1CD59转染A2780细胞,并用空质粒作为阴性对照.转染24 h后在含 400~800 mg/L G418 的RPMI 1640 中培养,2周后挑取单个克隆,连续传代10次,将piresWTCD59转染细胞命名为WTA,piresM1CD59转染细胞命名为M1A.
　　1.2.3       RTPCR检测转染细胞中CD59 mRNA的表达       提取细胞总RNA.以GAPDH为内参照,设计用于鉴定CD59全长基因的引物.上游引物:5′GGGAATCCAAGGAGGGTC3′;下游引物:5′AATGGAGTCACCAGCAGA3′.针对40位突变位点设计下游引物:5′TGCTCAAACTTACACTTGTTATACACT3′.反应条件为:反转录48 ℃ 45 min;预变性94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 45 ℃1 min, 68 ℃ 1 min,40个循环;延伸68 ℃ 7 min.扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳,并通过UVP Image Analysis Software凝胶分析软件比较条带相对亮度.
　　1.2.4       酶免疫组化检测CD59蛋白表达收集对数生长期的WTA2780、M1A2780及未转染A2780细胞,并用40 g/L多聚甲醛固定行免疫组化染色.依次与小鼠抗人CD59单克隆抗体、HRP羊抗鼠IgG二抗37 ℃作用45 min,最后DAB底物显色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片后镜下观察.
　　1.2.5       兔抗人A2780细胞抗血清的制备 应用2.5 g/L胰酶消化状态良好的A2780细胞,调整细胞密度至1.6×1011/L,以其免疫家兔,10 d后经心脏取血,分离血清,应用细胞凝集试验测定抗体效价为1∶5 120,分装,-20 ℃冻存备用.
　　1.2.6       抗补体活性检测       用MTT法测细胞增殖率间接反应CD59的抗补体活性.收集细胞,分为空白对照组、WTA组、M1A组以及A2780组、WTA+CD59mAb组、M1A+CD59mAb组、A2780+CD59mAb组共7组.除空白对照组以外,每组各孔分别加入兔抗A2780细胞抗血清(终浓度为1∶5 120)和新鲜人血清(终体积分数0.08)各1 μL,37 ℃孵育1 h.每孔各加入10 μL浓度为5 g/L的MTT,37 ℃孵育4 h后,弃去上清,加入10 μL的DMSO,吹打混匀,振荡溶解15 min,酶标仪测波长630 nm处吸光度(A)值,计算细胞抑制率.细胞抑制率=[1-(实验组平均A值-空白对照组平均A值)/(对照组平均A值-空白对照组平均A值)]×100%,重复3次取平均值.
　　1.3       统计学方法
　　应用SPSS 13.0及PPMS 1.5[4]统计学软件进行数据处理,结果以±s表示,组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有显著性.
　　2       结果
　　2.1       重组质粒的酶切鉴定
　　琼脂糖凝胶电泳检测结果显示, EcoRⅠ单酶切M1CD59质粒及WTCD59质粒均切下500 bp左右的CD59片段,证实这两种真核表达质粒扩增成功(图1).
　　2.2       CD59 mRNA的表达
　　WTA2780、M1A2780及未转染A2780细胞均有CD59(354 bp)和内参(500 bp)表达(图2、3),比较354 bp处条带相对亮度,WTA2780、M1A2780分别为1.78±0.07和1.75±0.05,未转染A2780细胞为1.07±0.09,WTA2780、M1A2780与未转染A2780细胞相比较,差异均有统计学意义(F=6.60,q=5.38、5.54,P<0.05), WTA2780、M1A2780比较差异无显著性(q=0.15,P>0.05),说明转染后CD59的mRNA表达高于未转染细胞.利用CD59上游引物与突变下游引物行RTPCR,M1A2780可扩增出一段204 bp的DNA产物,说明突变的CD59基因成功转入A2780细胞,并获转录表达(图3).
　　2.3       CD59蛋白表达
　　显微镜下可见染成棕褐色的阳性WTA2780、M1A2780细胞,未转染A2780细胞染色较阳性染色细胞显色较浅.
　　2.4       细胞增殖抑制率
　　本文空白对照组、WTA组、M1A组、A2780组、WTA+CD59mAb组、M1A+CD59mAb组以及A2780+CD59mAb组A值分别为0.037±0.001、0.764±0.050、0.712±0.019、0.665±0.087、0.437±0.035、  0.479±0.028、0.496±0.022,WTA+CD59mAb组、M1A+CD59mAb组以及A2780+CD59mAb组的细胞增殖抑制率分别为(22.90±2.95)%、(36.30±4.87)%、(29.60±3.16)%.WTA+CD59mAb组、M1A+CD59mAb组与A2780+CD59mAb组相比较,差异均有显著性(F=46.60,q=4.31、11.09,P<0.05);WTA+CD59mAb组与M1A+CD59mAb组比较,差异亦有统计学意义(q=12.43,P<0.05).
　　3       讨论
　　人CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固型糖蛋白,能抑制补体C9 结合C5b8,从而影响膜攻击复合物(MAC)的形成[5].国内外文献报道,胃癌、肠癌、肺癌、子宫内膜癌、神经纤维瘤、卵巢癌、前列腺癌等有CD59 的过表达,提示CD59 与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[6].DONIN等[7]研究显示,在对癌细胞的治疗中,如果能联合应用CD59分子的抗体,将极大提高癌细胞对补体杀伤作用的敏感性.BJORGE 等[8]从卵巢癌病人腹水中分离出的恶性细胞表面存在 C1q和C3活性物质,但在腹水及肿瘤细胞上未发现有活性的MAC.MAC的缺乏可能与肿瘤细胞膜补体调节蛋白CD46、CD55和CD59的表达有关.腹水中的CD59和CD46及其他补体抑制因子浓度较血清中增高,提示应用单克隆抗体抑制内源性补体调节蛋白的治疗,可激活补体发挥抗肿瘤效应[9].
　　CD59 分子抗补体活性区域主要集中于N37~H44 之间[10].ZHANG 等[11]在CD59 的种属选择性活性区域的研究中指出,Asp24、Trp40、Arg253、Leu54 是人类CD59 活性位点中重要的功能残基,我们推测CD59 第40 位保守氨基酸为关键位点, 卵巢癌细胞表面CD59活性位点是否为肿瘤细胞的特异位点国内外尚无报道.本研究利用阳离子脂质体转染法将含有Trp40缺失的PiresM1CD59及PiresWTCD59稳定转染A2780细胞,然后通过MTT法测定细胞增殖情况以反映CD59的抗补体活性,结果显示,转染组与未转染组抗补体活性差异无统计学意义,说明突变CD59 分子失去抗补体活性, 作为CD59 的重要活性位点,封闭Trp40位点可能使CD59 失去抑制补体的作用,增加补体的抗肿瘤效果.而经CD59mA6(CD59单克隆抗体)作用后,PiresWTCD59转染细胞的抗补体活性明显减弱,提示CD59mAb可能封闭了CD59的某些活性位点如第40位色氨酸,从而阻断了CD59的抗补体活性,大大降低了肿瘤细胞的逃逸功能.
　　【参考文献】
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