高效提取二相性白假丝酵母菌总RNA 实验研究
　　[摘要]目的: 探讨高效、简便提取白假丝酵母菌孢子相及菌丝相细胞总RNA 的方法.方法: 采用液氮法、超声法及玻璃珠( 直径0. 55 cm) 法提取白假丝酵母菌的孢子相和菌丝相细胞总RNA,紫外分光光度计检测所提取的二相性白假丝酵母菌总RNA 的OD260及OD280,琼脂糖凝胶电泳检测所提取的二相性白假丝酵母菌总RNA的完整性.结果: 液氮法、超声法及玻璃珠法提取白假丝酵母菌孢子相总RNA 的浓度分别为( 1. 021 ± 0. 145)g /L、( 0. 923 ± 0. 031) g /L、( 1. 121 ± 0. 175) g /L,纯度分别为1. 697 ± 0. 087、1. 474 ± 0. 064、1. 897 ± 0. 047; 液氮法、超声法及玻璃珠法提取白假丝酵母菌菌丝相总RNA 的浓度分别为( 0. 357 ± 0. 260) g /L、( 0. 287 ± 0. 023) g /L、( 0. 523 ± 0. 056) g /L,纯度分别为1. 548 ± 0. 047、1. 474 ± 0. 064、1. 874 ± 0. 064; 电泳结果显示,应用玻璃珠法提取的孢子相和菌丝相总RNA 28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA 三条带均明显显示,而采用液氮法、超声法提取的总RNA 三条带不明显.结论: RNAiso Plus 试剂联合直径为0. 55 cm 的玻璃珠法提取的白假丝酵母菌孢子相及菌丝相细胞的总RNA 浓度及纯度均较液氮法和超声法好,值得推广.
　　[关键词]白假丝酵母菌; RNA; 液氮; 超声; 玻璃珠
　　白假丝酵母菌是医院真菌感染中最常见的二相性真菌[1],因其具有坚硬的细胞壁,所以破坏其细胞壁是提取其细胞总RNA 的关键.目前有关提取白假丝酵母菌总RNA 的方法虽有报道,但都相对复杂繁琐,且需要特定的仪器或设备[2 - 3],本文分别采用3 种不同方法提取白假丝酵母菌孢子相、菌丝相细胞的总RNA,探讨高效、简便、经济提取二相性白假丝酵母菌总RNA 的快捷方法,为进一步从分子生物学水平研究二相性白假丝酵母菌奠定基础.
　　1 材料与方法
　　1. 1 菌株白假丝酵母菌标准菌株ATCC - 10231,贵阳医学院微生物学教研室保存.
　　1. 2 主要试剂及仪器酵母浸膏、葡萄糖、蛋白胨、琼脂粉( 上海博微生物科技有限公司) ,RPMI 1640 培养基( 北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司) ,优质胎牛血清( 天津灏洋生物制品科技有限责任公司) ,RNAisoPlus 试剂( TaKaRa 公司) ,DEPC 原液、溴化乙锭( Solarbio 公司) ,琼脂糖( 上海益博生物科技有限公司) ,0. 55 cm 玻璃珠( 天津玻璃仪器厂) ,液氮( 上海振兴化工一厂) ; 超声粉碎仪( 北京长源实验设备厂) ,高速台式冷冻离心机( 江苏太仓医疗器械厂) ,紫外分光光度计( 上海跃进医疗器械厂) ,微型水平凝胶有机玻璃电泳仪( 日本ADVANCE) ,凝胶成像分析仪( 北京长源实验设备厂) .
　　1. 3 二相性白假丝酵母菌的培养将白假丝酵母菌接种于10 ml YPD 液体培养基中, 37 ℃培养48 h 后,再转种于10 ml YPD 液体培养基中, 37 ℃培养12 h,获得孢子相细胞[4].将白假丝酵母菌接种于10 ml 含有20% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基( pH 7. 0) ,37 ℃、传代培养12次,待菌丝相细胞纯度达95% 以上后,于4 000 r /min 离心5 min 收集细胞,获得菌丝相细胞[5].分别用灭菌生理盐水将孢子相和菌丝相细胞浓度均调整为5 × 107 /ml,分别取1 ml 二相性菌悬液于DEPC 处理过的离心管内,10 000 r /min 离心10 min,并保留菌细胞沉淀用于后续实验.
　　1. 4 二相性白假丝酵母菌总RNA 的提取
　　1. 4. 1 液氮法分别在二相性菌细胞沉淀中加入1 ml RNAiso Plus 试剂,放入液氮中冻融,每次冻融5 s,间隔10 s,冻融4 次.
　　1. 4. 2 超声法分别在二相性菌细胞沉淀中加入1 ml RNAiso Plus 试剂,置于冰上,用超声粉碎仪进行破壁,功率调至400 W,工作时间为3 s /次,间隔15 s,总时间为15 min.
　　1. 4. 3 玻璃珠法分别在二相性菌细胞沉淀中加入400 μl RNAiso Plus 试剂,再放入10 粒0. 55 cm玻璃珠,于漩涡混合器( 转速为150 r /min) 上振荡5 min,再将振荡后的液体移入新的EP 管中,加入600 μl RNAiso Plus 试剂充分混匀,放置25 min.
　　1. 4. 4 总RNA 的提取分别将上述3 种方法处理得到的孢子相及菌丝相细胞中各加入200 μl 氯仿,充分混匀后放置10 min, 12 000 r /min 4 ℃离心15 min; 取上清液于新的离心管内,再加入等体积的异丙醇混匀后放置5 min, 12 000 r /min4 ℃离心10 min; 弃上清,加入1 ml 75%乙醇洗涤, 12 000 r /min 4 ℃离心10 min; 弃上清,置超净台晾干,加入20 μl DEPC 水溶解RNA 沉淀, 60 ℃水浴10 min.
　　1. 5 检测二相性白假丝酵母菌总RNA1. 5. 1 浓度和纯度的检测用紫外分光光度仪检测260 nm 及280 nm 波长下的OD 值,根据公式:
　　RNA 浓度( g /L) = ( OD260值× 40 × 稀释倍数) /1000,RNA 纯度= OD260 /OD280,计算出所提取的孢子相和菌丝相样本的总RNA 浓度和纯度.
　　1. 5. 2 完整性的检测用1. 0% 琼脂糖凝胶,90 V电泳15 min,经EB 染色的凝胶在凝胶成像分析仪上观察结果.
　　1. 6 统计分析使用SPSS 17. 0 统计学软件分析,数据采用均数± 标准差( x ± s) 表示,统计方法选用单因素方差分析,比较3 种方法所提取的总RNA 浓度和纯度差异,P < 0. 05 有统计学意义.
　　2 结果2. 1 总RNA 浓度和纯度比较玻璃珠法所提取的白假丝酵母菌孢子相和菌丝相总RNA 浓度和纯度均高于液氮法和超声法,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,并且玻璃珠法提取的总RNA 样品OD260 /OD280比值在1. 8 ~ 2. 0,而液氮法及超声法提取的总RNA 样品该比值小于1. 8,均有降解.结果见表1、2.
　　表1 三种方法提取的白假丝酵母菌孢子相总RNA 浓度和纯度( n = 10)Tab. 1 Concentrations and purities of total RNAextracted from yeast form of Candidaalbicans with three methods提取方法浓度( g /L) 纯度液氮法1. 021 ± 0. 145( 1) 1. 697 ± 0. 087( 1)超声法0. 923 ± 0. 031( 1) 1. 474 ± 0. 064( 1)玻璃珠法1. 121 ± 0. 175 1. 897 ± 0. 047注: ( 1) 与玻璃珠法比较,P < 0. 05.
　　表2 三种方法提取的白假丝酵母菌菌丝相总RNA 浓度和纯度( n = 10)Tab. 2 Concentrations and purities of total RNAextracted from hyphal form of Candidaalbicans with three methods提取方法浓度( g /L) 纯度液氮法0. 357 ± 0. 260( 1) 1. 548 ± 0. 047( 1)超声法0. 287 ± 0. 023( 1) 1. 474 ± 0. 064( 1)玻璃珠法0. 523 ± 0. 056 1. 874 ± 0. 064注: ( 1) 与玻璃珠法比较,P < 0. 05.
　　2. 2 总RNA 完整性的比较
　　将所提取的总RNA 样品经1. 0% 琼脂凝胶电泳,并在凝胶成像分析仪上观察发现,用玻璃珠法所提取的孢子相及菌丝相总RNA 样品可见清晰的3 条rRNA 条带,即28S rRNA、18S rRNA 和5SrRNA,液氮法与超声法提取的孢子相及菌丝相总RNA 完整性均较玻璃珠法差,见图1.
　　3 讨论
　　白假丝酵母菌是二相性真菌,具有孢子相和菌丝相两种形态,在一定条件下这两种形态可以相互转换,大多数研究认为,白假丝酵母菌孢子相转换成菌丝相是其致病的关键因素之一[6].因此,白假丝酵母菌二相性转换已成为当前研究的热点,而在体外诱导培养出高纯度的白假丝酵母菌孢子相和菌丝相细胞,并提取其二相细胞的总RNA,对于从分子生物学水平深入研究其二相性的转换至关重要.然而提取其总RNA 有一定难度,因为白假丝酵母菌是一种具有复杂、坚固细胞壁的真核细胞1: 玻璃珠法提取的孢子相细胞总RNA; 2: 液氮法提取的孢子相细胞总RNA; 3: 超声法提取的孢子相细胞总RNA;4: 玻璃珠法提取的菌丝相细胞总RNA; 5: 液氮法提取的菌丝相细胞总RNA; 6: 超声法提取的菌丝相细胞总RNA图1 三种方法提取的白假丝酵母菌孢子相及菌丝相细胞总RNA 的电泳结果Fig. 1 The electrophoresis results of total RNAextracted from yeast form and hyhpal formof Candida albicans with three methods型微生物,其细胞壁有4 ~ 8 层,主要成分是多糖,其中几丁质成分使白假丝酵母菌细胞壁较其它酵母菌细胞壁坚固,它的蛋白主要通过β-1,6支链葡聚糖与几丁质骨架结合[7],要提取浓度和纯度高、完整性好的白假丝酵母菌总RNA,破壁是其中一个关键的步骤.目前采用的白假丝酵母菌破壁方法主要有液氮法、破壁酶法、酸洗玻璃珠法、热酸性酚法、超声法等,而这些方法均繁琐、耗时,并且需要特定的仪器设备[2 - 4].
　　本实验采用新型RNAiso Plus 试剂,价格比传统Trizol 试剂便宜,且作为广谱型Total RNA 提取试剂,具有以下优点.( 1) 广谱性强,可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取Total RNA; ( 2) 纯度高,提取的Total RNA 基本不含蛋白质及基因组DNA,可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA 文库等各种分子生物学实验; ( 3) 快速简便,实验操作快速方便,整个操作在1 h 内便可完成; ( 4) 颜色鲜明,加入氯仿离心后,会形成无色的上清层和鲜红色的下层( 有机层) .
　　实验所应用的玻璃珠是直径为0. 55 cm 的普通玻璃珠,通过振荡机械性地破坏白假丝酵母菌细胞壁,以提取细胞总RNA.该方法的振荡时间不宜过短或过长,过短破壁不充分,核酸没有释放出  来,过长则会使释放出来的核酸被降解.研究发现振荡时间在5 min 并且振荡转速为150 r /min 时,提取的白假丝酵母菌总RNA 效果最佳.这与传统的酸洗玻璃珠相比,不仅价格便宜,且操作简单,振荡时间5 min,就能有效破坏白假丝酵母菌孢子相和菌丝相的细胞壁,所提取的总RNA 浓度、纯度及完整性均较液氮破壁法和超声破壁法好.使用液氮和超声法破壁提取的白假丝酵母菌酵母相和菌丝相总RNA 的纯度不高,分析其原因是液氮易挥发,实验操作不方便,因此导致破壁时间不够; 超声法需要特殊仪器,且超声时间如果不够,破壁就不充分,而超声时间过长,则总RNA 又容易被降解,并且超声法提取的总RNA 暴露于空气中,容易被污染.所以,液氮和超声法破壁提取的白假丝酵母菌酵母相和菌丝相总RNA 的浓度和纯度均不如玻璃珠法高.
　　本研究首次采用了RNAiso Plus 试剂联合直径为0. 55 cm 的玻璃珠法提取白假丝酵母菌孢子相和菌丝相细胞总RNA,所得到的白假丝酵母菌无论是孢子相还是菌丝相,其总RNA 浓度、纯度及完整性均较以往传统的液氮破壁法和超声破壁法提取的白假丝酵母菌孢子相和菌丝相细胞总RNA 浓度、纯度更高,并且完整性也更好.因此采用RNAiso Plus 联合直径为0. 55 cm 的玻璃珠法,用于提取白假丝酵母菌孢子相和菌丝相细胞的总RNA,高效、简便、经济实惠,不需要特殊的实验器材,就能满足分子生物学实验的需要,值得推广.