Slug基因敲除小鼠模型的建立

　　放射性肠道损伤是放、化疗治疗腹部及盆部肿瘤病人的常见并发症,肠道干细胞凋亡是导致损伤的主要原因[1-2].Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,具有凋亡抑制作用,可保护细胞免受细胞毒性损伤[3].我们前期的研究发现,Slug过表达能保护体外IEC6细胞免于射线损伤[4],但Slug敲除后能否促进体外、体内肠道干细胞损伤还不明确.

　　为研究Slug对放射性肠道损伤的作用,本研究首先建立Slug基因敲除小鼠模型,旨在为今后的研究做准备,也为放射性肠道损伤的预防治疗提供新思路.

　　1. 材料和方法

　　1.1主要材料

　　Slug基因敲除打靶载体由上海南方模式生物研究中心构建,各种限制性内切酶、T4、DNA连接酶、Taq酶及PCR试剂等购自TaKaRa及NEB公司,DNA marker购自晶美生物工程公司,质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司.细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品.引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成.ES细胞株Tc-1由美国国立卫生研究院的王中向博士惠赠.C57BL/6J小鼠由南方生物模式研究中心提供.

　　鼠尾基因组DNA裂解液,PCR相关试剂,Southern印迹相关试剂购自TaKaRa公司.[α-32P]dATP购自亚辉公司,硝酸纤维素膜购自S&S公司.

　　1.2 小鼠胚胎的获取与处理

　　引颈处死妊娠14天的雌鼠,75%酒精消毒,打开腹腔、取出有胚胎的子宫.在PBS中将胚胎从子宫中解剖出来,去除卵黄囊、羊膜和胎盘,将胎鼠在新的PBS中洗两次.将胚胎的头和内脏去除,用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片.将胎鼠碎片转移到15 ml离心管,1000 rpm离心2 min.将上述处理的胚胎碎片弃上清,加入5 ml 0.25%EDTA-胰酶,37℃处理30 min,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,反复吹打,1000 rpm,离心2 min.弃上清,加入滋养层细胞培养液并将细胞转移到150mm培养皿中,置于含5%CO2的培养箱中培养2-3天,通常第三天胚胎成纤维细胞长满培养皿,该细胞即是原始小鼠胚胎成纤维细胞.

　　1.3小鼠ES细胞的培养

　　ES细胞每2-3天按照1:3的比例传代一次.培养ES细胞的培养皿在接种培养层细胞前用0.1%明胶处理.传代过程:弃去原培养基,加入1.5 ml 0.25%胰酶消化5 min后,加入含有15%血清的DMEM高糖培养基中和胰酶反应.用吸管轻轻吹打,直至成为单细胞悬液.将细胞悬液按1:3的比例转移到新的含有饲养层的35 mm细胞培养皿中,补加相同培养基.将细胞悬液摇匀后,放入5%CO2、37℃培养箱中培养.每日换液,细胞长满继续传代.

　　1.4 ES细胞的电转及加压筛选

　　采用电转方法转染ES细胞,其条件参照文献[5].

　　1.5鼠尾基因组PCR

　　提取高质量鼠尾基因组,将DNA重悬于50μl TE中,37℃过夜溶解,可用作Southern印迹实验.基因组DNA的粗提:剪鼠尾约0.5 cm放入Ep管中,加入100μl SA液,置于95℃,50 min.加SB液100μl于Ep管内,震荡20次,3000 rpm离心10 min,取70μl上清备做PCR分析.RT-PCR引物(F:Forward,上游引物;R:Reverse,下游引物)

　　Slug 1 F:GGAAATTCTGCGGGAAAGGG  R:AGGACGGCGGGAGTGTTGGA;Slug 2  F:GCTATCTTGCCC

　　ACCCTACTC R:GTCACCCAGTCCCTGAACCT;Slug 3  F:AAATTCTGCGGGAAAGGGAT  R:CCAGGGTGAA

　　CTTGCTGTGAT;Slug4  F:CCAAGAGCAGGAGCAAGAAA  R:ATCAGGTCTAATGTTAGCATCCC;(注:4对引物为解决Slug第三个外显子敲除问题设计,其中Slug1为413bp,Slug 2为551bp ,Slug 3为205bp,Slug 4为319bp).基因型鉴定引物:Slug WT1:GTT CTG CTT TTG TCA CTA GAC ACT TGT TTT CTG CC  Slug WT2:TGG TTT CCC CTC GGA CCT GTA GGA AG

　　1.6 Western blot 分析

　　提取组织或细胞中总蛋白,参照说明书检测细胞内Slug蛋白表达.

　　1.7 Southern印迹鉴定基因敲除小鼠

　　用XbaⅠ在50μl体系内消化提取的鼠尾基因组DNA,37℃过夜,然后进行琼脂糖凝胶电泳.电泳结束后在紫外灯下照相,同时在凝胶边缘放置荧光尺记录迁移距离.在此步骤观察基因组DNA是否变成弥散状,如是则说明酶切成功.可以进行下一步实验.将胶进行修整,在Marker位置将上侧切角做标记,置于足够体积的0.25 M的HCl中浸泡,于摇床慢摇10-20 min,目的是使得较长片段断裂,有利于转膜.弃去盐酸,用去离子水冲洗2次,将凝胶置于足够体积的变性液中(1.5 MNaCl,0.5 M NaOH)浸泡45 min,摇床慢摇.目的是将DNA变性,有利于转膜.弃去变性液,去离子水冲洗2次,加入足够体积中和液(0.5 M Tris-Cl,pH,1.5 M NaCl),浸泡45 min,摇床慢摇.中间换液1-2次.目的是将pH值调回至适合转膜状态,同时继续增加盐离子浓度,有利于转膜.将凝胶置于20×SSC中,室温慢摇30 min.利用虹吸原理转膜,使得DNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维膜上, 转膜完毕后用铅笔标记加样孔位置,2×SSC漂洗1 min,将膜夹在滤纸中间80℃干烤2 h.将烤干的膜置于含有预杂交液(10×Denhardt's,4×SET,0.1%SDS,100μg/ml变性的鲑精DNA)的杂交瓶中,杂交炉温度为65℃,预杂交时间为1 h.在进行预杂交同时,进行探针的标记.将DNA探针和鲑精DNA于100℃加热5 min使其变性,迅速置于冰上预冷5 min,取50μlα-32P标记的DNA探针和100μl变性的鲑精DNA(10 mg/ml)加入新的预杂交液中.于杂交瓶中杂交过夜.将膜转移至漂洗液中(0.4×SET,0.1%SDS)中,于杂交瓶中洗三次,每次10 min.将膜置于滤纸间干燥,用保鲜膜包好夹在X光片中放进压片盒内,置于-70℃曝光1周后于暗室显片.

　　2. 结果

　　2.1 Slug嵌合体获得

　　Slug打靶载体经NotⅠ线性化后,电转(600 V,25μF)入小鼠ES细胞内.电转后24小时更换含有G418和Gancyclovir抗性的培养基进行加压筛选.利用G418筛选可以得到含有新霉素基因(neomycin)的ES细胞,这种细胞发生了打靶载体的插入,但是G418筛选无法排除打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞;潮霉素B则用来筛选不含有胸苷激酶(tk)的细胞,被杀死的细胞为打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞.这样利用"正负筛选"可以使得中靶细胞得到最大程度的富集.ES细胞在正负筛选培养基中培养7天后,挑取仍然存活的抗性ES克隆,以进行扩增培养.扩增后的抗性ES细胞克隆分成两份一份冻存,以备确定中靶细胞序列号后进行扩增培养和后续的囊胚注射;一份用来提取基因组DNA,进行中靶细胞的筛选.我们对挑取的96个克隆通过PCR策略初筛,得到3株中靶细胞,经Southern印迹的进一步验证,确定得到中靶细胞2株,排除的1株证实为PCR过程中出现的假阳性导致.将Southern印迹确证的中靶细胞复苏,于24孔板内扩增之后,进行囊胚注射,获得Slug的嵌合体小鼠.

　　2.2 Slug敲除小鼠的获得

　　由于囊胚来源于黑色的C57BL/6J小鼠,ES细胞则来源于褐色的129Sv小鼠,这样囊胚注射后出生的嵌合体小鼠会出现黑色、褐色及黑褐相间的花色.褐色在小鼠毛色中占的比例越高,说明注射的中靶细胞整合入囊胚的比例越大,从而将突变基因稳定遗传下去的几率也就越高.8只受体雌鼠经胚胎移植后,共生小鼠22只,其中6只灰色雌鼠和2只黑色雄鼠利用PCR筛选无法扩增到预期的突变型,说明没有发生嵌合.剩余14只均可以扩增到预期的突变型,为嵌合体小鼠.14只嵌合体雄鼠中,2只为高度嵌合,毛色为褐色;4只中度嵌合,毛色为黑色褐色相间的花色;剩余8只均为低度嵌合,毛色为黑色.14只嵌合体雄鼠性成熟后,与野生型的C57BL雌鼠交配,其中2只褐色和1只花色嵌合小鼠可以将Slug突变基因传至子代,得到杂合子小鼠.

　　2.3 Slug敲除小鼠的确证

　　杂合子小鼠合笼交配后子代可育.我们对断奶后的子代利用Southern印迹、RT-PCR和Western印迹实验分别在DNA、RNA和蛋白水平证实了Slug的敲除(Fig.1).成功得到了Slug敲除的纯合子小鼠.进一步的分析显示,Slug纯合子小鼠交配,可以得到后代,即:Slug敲除的小鼠可育.杂合子小鼠子代基因型符合孟德尔遗传定律.

　　Figure 1.Generation of Slug-deficient mice.A ,Analysis of the homologous recombination at different levels.PCR analysis of genomic DNA from Slug wild-type(WT),heterozygous,and homozygous mice.B,RT-PCR analysis of Slug expression using total RNA.  C,Southern blot analysis of the homologous recombination to the targeting construct.

　　3.讨论

　　利用基因工程小鼠研究基因功能是一种常用的实验策略.鉴于在ES细胞中发生同源重组的概率大大低于随机整合,我们筛选中靶细胞时采用的是正负筛选法,这种方法利用2种抗性基因,一正一反,将没有发生同源重组和发生随机整合的ES细胞杀死,来达到富集发生同源重组中靶细胞的目的.我们挑取了96个克隆,其中中靶细胞为2个,中靶概率2.1%.如此之高的中靶概率,使得采用Southern印迹直接筛选中靶细胞成为可能.对这96株细

　　胞我们全部进行了Southern印迹筛选,同时利用PCR策略进行了初筛,确定候选中靶细胞为3株.Southern印迹实验显示中靶细胞为2株,在PCR初筛的候选范围之内.这提示我们,对于Slug中靶细胞的筛选策略来说,PCR初筛过程中可能出现一定的假阳性,原因我们认为是挑取抗药单克隆过程中克隆挑取不纯,或者在基因组提取过程中出现了DNA的污染导致.而利用Southern印迹实验,则可以避免这一问题.这样我们在今后的中靶细胞筛选过程中就可通过PCR的方法初筛,将候选中靶细胞的范围缩小,然后再进行小规模的Southern印迹验证即可.但对于一些在PCR过程中容易出现假阴性的筛选策略来说,只能靠大规模的Southern印迹实验来筛选那些珍贵的容易在PCR过程中遗漏的中靶细胞.

　　选择敲除策略时,我们选择的是针对Slug第三个外显子进行的敲除,因为第三个外显子主要编码的是Slug位于N端的PH结构域,这主要考虑万一敲除不彻底进而产生截短体蛋白,那么该蛋白也已经丧失了介导其质膜定位的PH结构域,进而使得Slug丧失了原有的功能.结果表明对Slug敲除小鼠进行DNA,RNA和蛋白水平的验证,确实无法检测到野生型位点的存在.在转录水平,如果从第三个外显子内设计引物,在敲除小鼠内无法扩增到野生型条带,跨过第三个外显子的引物可以得到截短体的条带.这提示,在Slug的第三个外显子敲除之后,RNA水平还存在部分Slug缺失第三个外显子的RNA存在,但是这种RNA可能因为丧失了稳定性,无法进一步翻译成蛋白.

　　综上所述,我们将设计好的打靶载体电转至ES细胞,利用ES细胞内的同源重组机制将打靶载体置换入ES细胞基因组内,通过正负筛选得到中靶细胞,进而将经过PCR和Southern印迹验证的中靶细胞用囊胚注射技术植入囊胚.受孕母鼠所生嵌合体小鼠可以成功将携带的Slug突变基因传代至杂合子.Slug敲除小鼠可以存活,可生可育.Slug小鼠杂合子代符合孟德尔遗传定律,肉眼观察敲除小鼠无明显缺陷性表型,具有生育能力.

　　参考文献

　　[1]Hendry JH, Booth C, Potten CS.Endothelial cells and radiation gastrointestinal syndrome. Science. 2001;294(5546):1411.

　　[2]Lindsay KJ, Coates PJ, Lorimore SA, Wright EG.The genetic basis of tissue responses to ionizing radiation. Br J Radiol. 2007;80:S2-6.

　　[3]Wu WS, Heinrichs S, Xu D, Garrison SP, Zambetti GP, Adams JM. Slug antagonizes p53-mediated apoptosis of hematopoietic progenitors by repressing puma. Cell 2005; 123: 641-653

　　[4]迟绍云;焦学龙;王宝泉;刘春生;王蕾;陈栋.Slug减轻照射鼠肠上皮细胞损伤及作用机制.基础医学与临床.2012,12(2):39-42

　　[5]《基因打靶技术》杨晓,黄培堂,黄翠芬主编.科学出版社,2002.