亚甲基蓝对猪凝血酶病毒灭活/去除工艺验证实验
　　摘要: 目的验证亚甲基蓝光化学法灭活猪凝血酶中病毒的灭活效果,完善生产工艺.方法在SINV、EMCV、PPV 和PRV 等4 种病毒中,加入0. 5 mg /L 的亚甲基蓝置于病毒光照灭活仪上光照2 h 和用60 kD 膜超滤的灭活病毒方法来验证工艺的可行性.结果经亚甲基蓝可有效灭活病毒,经超滤法滤除可有效去除病毒.掺入到凝血酶原液中的病毒以及在原培养物中病毒都丧失了对细胞的感染性,降低的滴度TCID50高于4 Log10.结论亚甲基蓝光化学法可有效灭活猪凝血酶中病毒.
　　关键词: 凝血酶; 亚甲基蓝; 病毒
　　凝血酶( Thrombin) 是从猪血中提出的促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白,应用于创口,使血液凝固而止血的药品[1].但猪的血液制品中会带有一些人畜共患病毒原体[2-3],对药品的质量和人的健康产生重大的威胁.亚甲基蓝因其与细胞膜上的磷脂、蛋白质和核酸结合,经过一定波长的光照后,产生活性氧原子,破坏病毒脂包膜,从而灭活病毒[3-5].亚甲基蓝是一种治疗高铁血红蛋白血症的药品,人每天1 ~ 2 mg /kg 长期注射没有明显的副作用[6],其光化学法灭活血液成分中病毒的技术在欧美等发达国家开展多年,在国外已经开始应用于临床[7].所以我们在前期工作的基础上[8-9],结合动物源性生物制品的特殊要求,选择了SINV( 辛德毕斯病毒) 、EMCV( 脑心肌炎病毒) 、PPV( 猪细小病毒) 和PRV( 伪狂犬病病毒) 等4 种病毒代表了DNA、RNA、有囊膜和无囊膜病毒及过滤指示病毒,具有较好的代表性,确定作为本试验的指示病毒,用亚甲基蓝0. 5 mg /L 置于病毒光照灭活仪上光照2 h 和用60 kD 膜超滤的灭活病毒方法来验证工艺的可行性.
　　1 材料
　　凝血酶原液( 批号为100901、100902、100903) ,长春远大国奥药业有限公司; DMEM 培养基、胎牛血清、抗生素( 双抗) 、胰酶,Gibco 公司; 60 kD 超滤管,长春Hyclone 科技有限公司.
　　SINV、EMCV、PPV、PRV、传代细胞系PK-15( 猪肾细胞) 、Vero( 非洲绿猴肾细胞) 均由本实验室保存.
　　2 方法
　　2. 1 病毒制备
　　按常规细胞培养方法进行[10],在细胞培养瓶中用DMEM 培养液加10% 胎牛血清作为细胞的培养液( pH 7. 2) , 37 ℃,5 % CO2培养,在细胞传代时用0. 25%胰酶消化细胞.在PK-15 细胞传代时同步接种PRV 和PPV; 在Vero 细胞生长为单层时接种EMCV和SINV.接种量为0. 5 mL /瓶( 50 mL 培养瓶) ,连续培养,待出现明显的细胞病变( CPE) 后于- 20 ℃和37 ℃反复冻融3 次,收集病毒液.以未接种病毒的细胞作为阴性对照细胞.
　　2. 2 细胞半数感染量( TCID50 ) 的测定
　　按常规方法[11],将传代消化后的细胞稀释成约105 ~ 106 个/mL 后,转入96 孔培养板中,用0. 18mL /孔; 待Vero 细胞隔夜长成单层后接种EMCV 和SINV、PK-15 细胞传代时同步接种PRV 和PPV,接毒时将病毒液作连续的10 倍稀释,每个稀释度分别接种8 孔,0. 1 mL /孔,并用生理盐水作阴性对照,置37 ℃,5% CO2培养,每天观察细胞病变并记录,按Reed-Muench 法计算TCID50.
　　2. 3 模拟工艺样品的制备
　　2. 3. 1 亚甲基蓝病毒灭活实验随机抽取原液,在超净台内打开,每支2 mL 冻存管中加入原液1. 8mL; 每管再加入指示病毒各0. 2 mL( 样品中最终病毒滴度大于6. 5Log10) ,作为亚甲基蓝试验检测对照组.再在其中加入亚甲基蓝至0. 5 mg /L,作为亚甲基蓝组.按生产工艺中的病毒灭活/去除工艺样品进行处理,将掺入病毒标记为亚甲基蓝组对照的冻存管,放入病毒灭活光照培养箱,照射2 h,作为下一步病毒灭活效果检测的样品.
　　2. 3. 2 超滤病毒滤除实验随机抽取原液,在超净台内打开,每支2 mL 冻存管中加入原液1. 8 mL; 每管再加入指示病毒各0. 2 mL( 样品中最终病毒滴度大于6. 5Log10) ,用60 kD 超滤管进行超滤,作为超滤法灭活效果检测的样品,标记为超滤.同时做不掺入病毒的样品对照、培养基替代原液加入病毒的对照.
　　2. 4 病毒灭活滴度测定
　　按2. 1 项下方法将传代消化后的细胞稀释成约105 ~ 106 个/mL 后细胞转入96 孔细胞板,血清浓度为2%,Vero 细胞贴壁生长后倾去培养基,重新加入培养基0. 09 mL 后接毒; PK-15 细胞按0. 09 mL /孔传代至培养板同步接毒.
　　3 结果
　　3. 1 两种病毒原液的制备与滴度测定
　　分别测定病毒的TCID50.通过倒置显微镜观察,接种EMCV 和SINV 的Vero 细胞接种24 h 后出现折光性减弱,部分细胞圆缩、脱落、呈拉网状, 48 h后80%以上的细胞出现CPE,培养液中悬浮大量的脱落坏死细胞; 接种PRV 和PPV 72 h 后的PK-15细胞出现脱落、拉网等明显的CPE.未接种病毒的Vero 和PK-15 保持贴壁生长,细胞形态完整,未发现有明显变化.分别接种病毒48 h 收集病变的Vero细胞、72 h 收集PK-15 细胞培养液,各收获30mL,分装冻存管中,作为本试验的病毒原液.统计并按Reed-Muench 法计算TCID50,测定EMCV 的TCID50为6. 71Log10 /0. 1 mL,PPV 的TCID50为6. 89Log10 /0. 1 mL 稀释的病毒液,SINV 的TCID50为6. 65Log10 /0. 1 mL 稀释的病毒液,PRV 的TCID50为7. 2Log10 /0. 1 mL 稀释的病毒液.
　　3. 2 模拟工艺病毒灭活滴度测定
　　3. 2. 1 亚甲基蓝灭活实验结果经亚甲基蓝灭活后的样品加入到培养液中观察72 h 后,对照细胞生长正常.与对照组相比SINV、EMCV 和PRV 病毒滴度降低4Log10 以上,而对无包膜病毒PPV 无明显影响.
　　3. 2. 2 超滤滤除病毒实验结果经超滤滤除后的样品加入到培养液中观察72 h 后,对照细胞生长正常.结果与对照组相比SINV、EMCV、PPV 和PRV病毒滴度都降低4Log10 以上.
　　4 讨论
　　将SINV、EMCV、PPV 和PRV 病毒掺入到凝血酶原液后,经亚甲基蓝可有效灭活病毒,经超滤法滤除可有效去除病毒.掺入到凝血酶原液中的病毒以及在原培养物中病毒都丧失了对细胞的感染性,滴度降低4Log10 以上,而其他对照显示处理后的注射液对细胞没有毒性.以上结果说明这两步工艺均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则[S]GPH3-1》和国食药监注[2008]《关于发布化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求的通知》的要求,证明两种方法均是有效的灭活/去除病毒工艺.