均匀设计优化青皮中橙皮苷的提取工艺
　　摘要: 目的优选青皮中橙皮苷的提取工艺.方法采用均匀分布设计方法,以橙皮苷含量为评价指标进行U6( 64 ) 试验,筛选最佳提取工艺.结果最佳提取工艺为8 倍量90%乙醇,超声3 次,20 min /次,青皮中橙皮苷的含量为8. 17%.结论本实验建立的提取方法简单、稳定、可行,可为青皮的生产工艺提供理论依据.
　　关键词: 青皮; 橙皮苷; 均匀设计; 提取工艺
　　青皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco 及其栽种变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮.5 ~ 6月收集自落的幼果,晒干,习称"个青皮"; 7 ~ 8月采收的未成熟果实,在果皮上纵剖成四瓣至基部,除尽瓤瓣,晒干,习称"四花青皮"[1].青皮为常用中药,性味苦辛、微温,有破气行痰、消痞除满之功效,是一种药用广泛又经济的中药[2].
　　本实验采用四因素,六水平的均匀设计法安排实验,优选出合理的橙皮苷提取工艺,为生产工艺的参数选择提供理论数据.
　　1 仪器与试剂L - 2000 高效液相色谱仪( 日本日立公司,配二极管阵列检测器) ; 分析天平( 北京赛利斯仪器有限公司) ; KQ - 100A 型超声波提取器( 昆山市超声仪器有限公司) .
　　橙皮苷对照品( 中国药品生物制品检定所,批号110721 - 200613) ; 青皮药材( 购于锦州市健康源大药房) ,经本院生药教研室承伟教授鉴定为青皮正品; 甲醇( 色谱纯、天津市风船化学试剂科技有限公司) ; 双蒸水由1810 - B 型石英自动双重纯水蒸馏器制得.其它试剂均为分析纯.
　　2 方法与结果
　　2. 1 橙皮苷的含量测定
　　2. 1. 1 供试品溶液的制备精密称取青皮药材6份,每份10 g,按均匀设计方案采用乙醇超声提取法提取青皮中的橙皮苷,过滤,合并滤液,定容在200 mL 容量瓶中,即得供试品溶液.
　　2. 1. 2 对照品溶液的制备精密称取120 ℃减压干燥至恒重的橙皮苷对照品10. 0 mg 溶于25 mL 的容量瓶中,加50% 乙醇溶解并稀释至刻度备用.
　　即得( 每1 mL 含橙皮苷0. 4 mg) .
　　2. 1. 3 色谱条件的选择色谱柱: Hypersil ODS( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm) ; 流动相: 甲醇- 水( 40∶ 60) ; 流速1. 0 mL /min; 柱温: 35 ℃; 检测波长: 284 nm,进样量: 20 μL.
　　2. 1. 4 标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0. 5、1、2、4、8 mL 至10 mL 容量瓶中,用50%乙醇定容至刻度,制得5 种不同浓度的对照品溶液,按上述色谱条件依次进样,进样量20 μL,测定.以峰面积积分值为纵坐标,对照品的进样浓度为横坐标进行线性回归,得到回归方程为: ^Y =38452. 5538X + 13789. 0833,相关系数r = 0. 9994.
　　结果表明,橙皮苷进样浓度0. 02 ~ 0. 32 mg /mL 范围内与峰面积呈良好线性关系.
　　2. 1. 5 精密度考察精密量取同一供试品溶液,按2. 1. 3 项下的色谱条件连续进样6 次,测定峰面积值,得橙皮苷峰面积RSD = 2. 41%,表明仪器精密度良好.
　　2. 1. 6 稳定性考察取配制好的的供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10 h 进行测定,RSD =1. 45%,说明该样品溶液在10 h 内稳定性良好.
　　2. 1. 7 加样回收率实验精密称取青皮样品,按2. 1. 1 项下制备供试品溶液,分为浓度不等3 份,分别加入橙皮苷对照品适量,计算回收率,结果平均回收率为99. 10%,RSD 为2. 10%.
　　2. 2 均匀试验设计2. 2. 1 因素水平及指标的确定采用乙醇超声提取青皮中橙皮苷,主要影响因素为乙醇浓度A( %) 、溶剂用量B ( 倍) 、提取次数C ( 次) 、提取时间D ( min) 4 个因素,故以此4 因素为参考水平,共设6 个水平,进行均匀设计试验,优选最佳提取条件.用U6 ( 64 ) 均匀设计表安排试验,以橙皮苷含量为评价指标.因素水平表见表1.
　　表1 因素水平表水平因素A 溶剂浓度( %)B 溶剂用量( 倍)C 提取时间( min)D 提取次数( 次)1 30 5 20 12 50 8 30 23 60 10 40 34 70 15 20 15 80 20 30 26 90 25 40 32. 2. 2 实验安排及结果按2. 1. 1 项下方法制备供试液,分别吸取0. 5 mL,用微孔滤头滤过,采用高效液相色谱仪测定峰面积,由回归方程计算出橙皮苷的含量并进行方差分析.均匀实验安排及结果见表2,方差分析结果见表3.
　　表2 均匀设计实验安排表水平因素A 溶剂浓度( %)B 溶剂用量( 倍)C 提取时间( min)D 提取次数( 次)橙皮苷含量%1 30 5 20 1 2. 8602 50 8 30 2 3. 0603 60 10 40 3 3. 1524 70 15 20 1 6. 305 80 20 30 2 7. 396 90 25 40 3 3. 45表3 方差分析表方差来源平方和自由度均方F P回归来源3. 865 4 0. 966 0. 851剩余1. 135 1 1. 135总和5. 000 5将表2 数据输入计算机,通过SPSS - 19 软件进行数据处理,采用逐步回归进行多元线性回归处理,最后优选确定回归方程为Y = 4. 278 + 0. 178 ×A - 0. 601 × B - 0. 573 × C + 0. 107 × D.
　　由表3 可知,复相关系数N = 6,r = 0. 879,F= 0. 851,P < 0. 05,回归方程在α = 0. 05 水平上有显著意义.从回归方程可以看出因素A,D 项的回归系数为正,说明乙醇的浓度和提取次数取水平的上限为好,因数B,C 的回归系数为负,说明溶剂用量和提取时间取水平下限为好.根据自动实验优化预测: 乙醇浓度90%,溶剂用量8 倍,提取时间20 min,提取次数3,橙皮苷含量预测值8. 31%.
　　2. 2. 3 验证试验根据优化工艺进行橙皮苷的提取,制备3 批样品,测定其中橙皮苷含量,见表4.得平均值Y = 8. 17%,与理论推测值相近,在其范围区间3 讨论查阅文献[3 - 4],可以选择乙醇、甲醇等作为提取溶剂.选用甲醇提取时,提取物中的黄酮类化合物含量高,但成本较高,不适宜工业化生产,所以选用乙醇作为提取溶剂.
　　笔者曾考察不同提取方法对青皮中橙皮苷的含量影响,分别采用冷浸法、温浸法、超声波提取法、回流提取法、渗漉法进行提取.实验结果表明以超声提取法得到的橙皮苷含量最高,其次分别为回流提取法、渗漉法、温浸法、冷浸法.各方法所得橙皮苷含量依次为: 7. 29%、5. 31%、4. 85%、3. 77%,因此超声提取法为最佳提取方法.
　　通过均匀设计试验结果分析,确定乙醇浓度为影响青皮中橙皮苷提取率的主要因素,影响显著,而溶剂用量对青皮中橙皮苷提取率的影响很小,不显著.最后确定最佳提取工艺为乙醇浓度为90%,提取次数为3 次,乙醇用量为8 倍,提取时间为每次20 min.均匀设计试验验证结果与预测结果基本接近,表明该提取工艺稳定、可行.