聚山梨酯80 辅助酶法制备柚皮素的研究
　　摘 要:目的 研究在柚皮苷酶解液中加入聚山梨酯80 后辅助酶解制备柚皮素.方法 将聚山梨酯80 加入柚皮苷酶解液中,以转化率为指标,通过单因素考察聚山梨酯80 的质量浓度、pH 值、温度、酶与底物的质量比、底物质量浓度及反应时间对转化率的影响,并通过正交试验优化其制备工艺;采用1H-NMR、13C-NMR 鉴定水解产物.结果 柚皮苷在最佳酶解条件下(聚山梨酯80 质量浓度5 g/L、pH 4.0、温度37 ℃、酶与底物的质量比0.6、底物质量浓度30 mg/mL 和反应时间12 h)的转化率为(97.4±1.2)%,远大于未加聚山梨酯80 时柚皮苷的转化效率(56.7±1.4)%;反应产物相对分子质量为272.25,核磁共振谱证实产物为柚皮素.结论 在柚皮苷酶解液中加入聚山梨酯80 后酶解制备柚皮素,可以缩短反应时间、提高底物质量浓度、减少酶用量,从而显著提高转化效率.该工艺简单稳定,适合工业化生产.
　　关键词:柚皮素;转化效率;聚山梨酯80;柚皮苷;酶解;正交试验
　　柚皮素为芸香科柑橘属植物中的一种多羟基黄酮类单体成分.药理研究表明,柚皮素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗溃疡、抗血栓和扩张血管作用[1-9].
　　但是柚皮素在植物中质量分数很低,一般以柚皮苷的形式存在于自然界中[10],可以通过水解糖苷键制备柚皮素.但是,柚皮苷溶解度小,在酶解过程中通常存在酶解时间过长的问题[11].为增加柚皮苷的溶解度,提高反应速率和转化率,可以在酶解液中加入聚山梨酯80.聚山梨酯80 具有双亲分子结构,能降低固-液相界面张力,增加难溶性药物的溶解度[12-13],使用质量浓度范围为1%~12%[14-16].聚山梨酯80 能够广泛应用的原因在于其低质量浓度时的有效性、成本低、毒性小[17-18].蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的一种混合酶[19-22].本实验在柚皮苷的反应液中加入聚山梨酯80,增加柚皮苷的溶解度,并采用蜗牛酶将其水解制备柚皮素,通过单因素试验和正交试验优化反应条件,为柚皮素的工业化生产提供参考.
　　1 仪器与材料高效液相色谱仪(Waters,600 型泵,717 自动进样器,Empower 数据处理系统);数显气浴恒温振荡器(金坛市双捷实验仪器厂);瑞士Bruker(AV300)核磁共振仪,溶剂为氘代DMSO.
　　柚皮苷(批号XC101226,质量分数≥98%)、柚皮素(批号XC101122,质量分数≥98%)对照品购自西安小草植物科技有限责任公司,蜗牛酶(北京拜尔迪生物科技有限公司).甲醇、乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯.
　　2 方法与结果
　　2.1 柚皮苷溶解度的测定
　　2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex? C18 柱(150 mm×4.60 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水(38∶62),体积流量1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长285 nm.
　　2.1.2 对照品溶液的配制 取柚皮苷对照品10mg,精密称定,置10 mL 量瓶中,加适量无水乙醇溶解并定容至刻度,即得1.003 mg/mL 柚皮苷对照品储备液.
　　2.1.3 供试品溶液的制备 取蒸馏水3 份各1 mL,置5 mL 具塞离心管中,分别加入过量的柚皮苷,其中第1 份不加聚山梨酯80,第2 份加入1 g/L 聚山梨酯80,第3 份加入5 g/L 聚山梨酯80,充分混匀,放入数显气浴恒温振荡器,调节转速(100±5)r/min,温度25 ℃,平衡72 h,使其充分溶解.
　　2.1.4 溶解度计算 柚皮苷的溶解度采用外标一点法进行测定.取"2.1.3"项所得混悬液经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液500 μL 放入1 mL 量瓶中,并加甲醇定容,摇匀后离心,取上清液注入高效液相色谱仪检测.每个样品重复3 次,取其平均值.
　　计算得柚皮苷的溶解度为1.9 μg/mL,加1 g/L 聚山梨酯80 后柚皮苷溶解度为22.8 μg/mL,加5 g/L 聚山梨酯80 后柚皮苷溶解度为40.3 μg/mL.
　　2.2 柚皮素转化率的测定
　　2.2.1 对照品溶液的制备 取柚皮素对照品10mg,精密称定,置10 mL 量瓶中,加适量无水乙醇溶解,加无水乙醇至刻度,超声除去气泡,再用无水乙醇补足至刻度即得1.058 mg/mL 柚皮素对照品储备液.
　　2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取一定量的柚皮苷、蜗牛酶和聚山梨酯80,加入一定pH 值的缓冲溶液定容至一定体积,放入数显气浴恒温振荡器,调节转速(130±5)r/min,在一定温度下反应一段时间,即得供试品的混悬溶液.
　　2.2.3 线性关系考察 精密移取柚皮素对照品储备液,加无水乙醇稀释成169.26、84.64、42.32、21.16、10.58 μg/mL 对照品溶液,进样测定.以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得回归方程Y=253.57 X-23.28,r=0.999 7,表明柚皮素在10.58~169.26 μg/mL 与峰面积线性关系良好.
　　2.2.4 精密度试验 精密吸取柚皮素对照品溶液20 μL,重复进样6 次,分别测定柚皮素的峰面积值,RSD 为1.25%.
　　2.2.5 稳定性试验 分别在0、2、4、6、8、12、24 h 时测定柚皮素对照品溶液的峰面积,RSD 为1.23%,说明对照品溶液在24 h 内稳定.
　　分别在0、2、4、6、8、12、24 h 时测定柚皮素供试品溶液的峰面积,RSD 为1.46%,说明供试品溶液在24 h 内稳定.
　　2.2.6 重复性试验 按"2.2.2"项下平行制备5 份供试品溶液,并按"2.1.1"方法分别进样20 μL,测定,计算柚皮素质量分数的RSD 为1.05%.
　　2.2.7 回收率试验 精密量取已知含量的柚皮素转化液样品0.1 mL,精密加入对照品储备溶液0.5mL,用甲醇定容至10 mL,测定,计算平均回收率为98.75%,RSD 为1.31%.
　　2.2.8 柚皮素转化率的测定 精密量取0.1 mL 转化后的混悬液,加无水乙醇定容至10 mL,摇匀后用0.45 μm 的微孔滤膜滤过,高效液相色谱仪检测,计算转化率.
　　转化率=CVM2/(mM1)C 为柚皮素的质量浓度,V 为体积,m 为加入的柚皮苷质量,M1 为柚皮素的相对分子质量,M2 为柚皮苷的相对分子质量2.3 蜗牛酶酶解柚皮苷的单因素考察将聚山梨酯80 的质量浓度、反应液pH 值、反应温度、酶与底物的质量比、底物质量浓度和反应时间分别固定在1 g/L、4.5、37 ℃、1∶1、10 mg/mL、24 h,以柚皮素的转化率为衡量指标,只改变其中1个条件进行试验,考察制备过程中各单因素水平的影响.
　　2.3.1 聚山梨酯80 质量浓度对柚皮素转化率的影响 按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,聚山梨酯80 的质量浓度分别为1、2、3、4、5 g/L,结果柚皮素转化率分别为31.2%、44.7%、56.8%、61.1%、70.9%.柚皮素的转化率随着聚山梨酯80 质量浓度的增加而增大,在考察的范围内,选择聚山梨酯80 的质量浓度为5 g/L.
　　2.3.2 反应液pH 值对柚皮素转化率的影响 按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,反应液pH 值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,结果柚皮素转化率分别为20.1%、32.5%、38.3%、52.9%、40.4%、22.8%.柚皮素的转化率随反应液pH 值的升高而增加,当pH 值达到5.5 时,转化率达到最大值,随着pH 值的继续增加转化率出现降低.
　　2.3.3 反应温度对柚皮素转化率的影响 按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,反应温度分别为25、37、50、60、70 ℃,结果柚皮素转化率分别为18.9%、99.6%、62.4%、37.9%、8.5%.柚皮素的转化率随反应温度的升高而增加,当温度达到37 ℃时,转化率达到最大值,随着温度的继续增加转化率降低.
　　2.3.4 酶与底物的质量比对柚皮素转化率的影响按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,酶与底物的质量比分别为1∶10、1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、1∶1,结果柚皮素转化率分别为32.3%、77.4%、86.1%、99.3%、98.5%、99.1%.
　　柚皮素的转化率随酶与底物质量比的增大而增加.
　　当酶与底物的质量比为3∶5 时,转化率不再增加,基本保持不变.
　　2.3.5 底物质量浓度对柚皮素转化率的影响 按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,底物质量浓度分别为5、10、20、30、40 mg/mL,结果柚皮素转化率分别为36.7%、62.3%、78.1%、99.2%、82.4%.柚皮素的转化率随底物质量浓度的增大而增加,当底物质量浓度达到30 mg/mL 时,转化率达到最大值,随着底物质量浓度的继续增大转化率出现降低.
　　2.3.6 反应时间对柚皮素转化率的影响 按"2.2.2"项下方法酶解柚皮苷.在其他条件不变的情况下,反应时间分别为2、4、8、12、24 h,结果柚皮素转化率分别为20.8%、34.5%、61.7%、79.6%、99.8%.
　　柚皮素的转化率随反应时间的延长而增加.当反应时间为24 h 时,转化率接近100%.
　　2.4 蜗牛酶酶解柚皮苷的正交试验柚皮苷酶解制备柚皮素时,在单因素考察的基础上,确定了反应液pH 值、反应温度、底物质量浓度及反应时间对柚皮素的转化率较大,所以以柚皮素的转化率为指标,选取反应液pH 值(A)、反应温度(B)、底物质量浓度(C)、反应时间(D)为因素,确立了3 个水平,试验设计与结果见表1,方差分析见表2.
　　从表1 直观分析可知,影响柚皮素转化率的4个因素的主次顺序为A>B>D>C,即反应液pH值>反应温度>反应时间>底物质量浓度,最佳组合为A1B2C2D2.从表2 的方差分析可知,相对于底物质量浓度(因素C),反应液pH 值(因素A)和Table 2 Analysis of variance方差来源偏差平方和自由度 F 比 显著性A 1 024.482 2 67.391 P<0.05B 496.469 2 32.658 P<0.05D 37.029 2 2.436C (误差) 15.202 2F0.05(2, 2)=19.00 F0.01(2, 2)=99.00反应温度(因素B)对柚皮素转化率的影响具有显著性(P<0.05),反应时间(因素D)的影响不具有显著性.确定最佳制备工艺条件为反应液pH 值4.0,反应温度37 ℃,底物质量浓度30 mg/mL,反应时间12 h.
　　2.5 验证试验采用正交试验确定的最佳工艺条件制备3 批样品,测得转化率分别为98.8%、96.6%、96.8%,平均转化率为(97.4±1.2)%.由此可见该工艺稳定性、重复性良好.
　　在酶解供试品的最佳条件下,酶解未加聚山梨酯80 时的柚皮苷,测得转化率分别为55.1%、57.1%、57.9%,平均转化率为(56.7±1.4)%.
　　2.6 柚皮素的纯化和结构鉴定以30 mg 柚皮苷为底物进行酶解反应,然后将酶解产物溶于乙醇中,重结晶精制3 次,干燥,得淡黄色针晶12.6 g.适量晶体用甲醇溶解,在"2.1.1"项条件下测定,外标法计算,质量分数>98%.1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 12.18 (1H, s, 5-OH),9.07 (1H, s, 7-OH), 7.37 (2H, dd, J = 8.7, 3 Hz, 2′,6′-H), 6.85 (2H, dd, J = 8.7, 3 Hz, 3′, 5′-H), 5.94 (2H,s, 6, 8-H), 5.45 (1H, dd, J = 12.6, 3 Hz, 2-H), 3.22(1H, dd, J = 17.5, 12.6 Hz, 3a-H), 2.73 (1H, dd, J =17.5, 3 Hz, 3b-H);13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ:
　　79.8 (d, 2-C), 42.9 (t, 3-C), 196.7 (s, 4-C), 163.8 (s,5-C), 102.7 (s, 5a-C), 96.3 (d, 6-C), 167.3 (s, 7-C),95.6 (d, 8-C), 164.8 (s, 8a-C), 129.9 (s, 1′-C), 129.1(d, 2′, 6′-C), 115.7 (d, 3′, 5′-C), 158.2 (s, 4′-C).以上数据与文献报道柚皮素一致[23].由此可知,柚皮素的得率为89.7%.
　　3 讨论
　　常温下,柚皮苷在水中的溶解度为1.9 μg/mL,是难溶于水的化合物.在其水溶液中加入1 g/L 聚山梨酯80 后,溶解度为22.8 μg/mL,提高12 倍;加入5 g/L 聚山梨酯80 后,溶解度为40.3 μg/mL,提高21.2 倍.聚山梨酯80 对柚皮苷增溶作用明显,为聚山梨酯80 提高酶解速率提供了基础条件.
　　柚皮苷属于氧苷类,是柚皮素7 位酚羟基与糖缩合而形成的β-D-葡萄糖苷.柚皮苷水解方法一般包括酸法水解、酶法水解等.酶水解法作为一种绿色安全的方法,能够很好地保持产物的结构,更加适合工业化生产.贾东升等[24]利用纤维素酶酶解淫羊藿苷,制备宝藿苷I 的平均转化率为(94.38±1.02)%,最佳反应时间为48 h,底物浓度为10mg/mL.贾东升等[25]利用蜗牛酶酶解淫羊藿苷制备淫羊藿苷元,平均转化率(92.46±1.17)%,最佳反应时间为48 h,底物浓度为10 mg/mL.本课题组研究表明由于柚皮苷难溶于水,酶解反应时间很长,大量占用设备和场地资源,不利于规模化制备.
　　本研究在柚皮苷酶解液中加入聚山梨酯80,增大柚皮苷的溶解度,从而提高酶解制备柚皮素的效率.通过单因素实验考察了聚山梨酯80 的质量浓度、pH 值、温度、酶与底物的质量比、底物质量浓度及反应时间对柚皮苷酶解制备柚皮素的影响,确定了进一步实验的范围,并通过正交试验优化其制备工艺.依据分析结果可知,在柚皮苷酶解液中加入聚山梨酯80 反应的最适条件为聚山梨酯80 质量浓度5 g/L、pH 4.0、温度37 ℃、酶与底物的质量比0.6、底物质量浓度30 mg/mL 和反应时间12 h,柚皮素在此最佳条件下的转化率为(97.4±1.2)%.
　　而本课题组前期经过单因素考察和正交试验设计得知柚皮苷的最佳工艺条件为pH 4.5、温度37 ℃、酶与底物比为2∶1、底物质量浓度为5 mg/mL 和反应时间36 h.在最佳条件下,柚皮苷的转化率为(96.36±2.3)%.由此可见,难溶性药物由于在酶解体系中溶解度较小,严重影响反应速率,在其反应液中加入聚山梨酯80 后,可提高溶解度、减少酶用量、缩短反应时间,适于工业化生产.