基因敲除技术在结核分枝杆菌研究中的应用
　　【关键词】 基因敲除; 结核分枝杆菌; 结核病
　　随着结核分枝杆菌全基因组被测序,功能基因组学成为时下结核分枝杆菌研究的热点.研究基因功能的方法主要有两种思路:一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究;二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能.前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃.后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除技术[1].
　　1 基因敲除技术
　　基因敲除技术又称基因剔除,是自20世纪80年代开始发展起来的,通过一定途径使机体特定基因失活或缺失的一种分子生物学技术.基因敲除利用基因同源重组原理,用含有已知的外源性DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得以表达,从而改变细胞的基因型,以研究该基因的体内功能或相关疾病的致病机制[2-3].
　　基因敲除的技术路线如下:第1步,构建重组基因载体,其构建的成功与否是进行基因敲除的关键.第2步,转染质粒载体导入待敲除的靶细胞中,方法有磷酸钙DNA 共沉淀法、电穿孔法、逆转录病毒感染法等.第3步,用选择培养基筛选已转染好的细胞.第4步,观察被击中细胞的生物学特征,将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长,对转基因动物进行形态学及分子生物学检测.
　　2 基因敲除技术在结核分枝杆菌研究中的应用
　　2.1 寻找新的抗结核药物的作用靶点
　　结核分枝杆菌的细胞壁结构独特,对细菌的生命、形态、毒性传播等非常重要,也是目前多种抗结核药物作用的靶点.结核分枝杆菌细胞壁中具有两种主要成分,即分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖(mAGP)和脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)[4].mAGP是细胞壁的核心结构,为一种复杂的脂多糖肽,由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖3种成分组成.阿拉伯聚糖半乳聚糖通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子,共价连接到肽聚糖大分子上;分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖(mAGP)直接影响了细胞壁的完整性,是药物作用良好的靶点.在细胞壁的核心结构mAGP中,乙酰葡糖胺(GlcNAc)是其中必需的组成成分,主要参与组成肽聚糖和L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子.GlcNAc的活性前体是UDP-GlcNAc[5].GlmU 是UDP-GlcNAc合成过程的一种重要酶,GlmU 是双功能酶,具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性.在结核分枝杆菌(M.tuberculosis)中,编码GlmU的基因是GlmU,在基因组上的定位为Rv1018c.现已构建了GlmU 基因敲除的菌株mc2155GlmU 敲除(KOT),此菌株与结核分枝杆菌亲缘关系近、细胞壁结构相似,且无致病性,可被用于对M.tuberculosis的研究;通过对此菌株生长曲线的测定,已证实GlmU基因为分枝杆菌生长所必需.由于GlmU在细菌生长过程中具有必不可少的作用,并且对细胞壁完整性具有重要影响,当缺失活性GlmU时,阿拉伯糖含量增加,且其增加是来自于具有分支的阿拉伯糖末端的增多.由此推断,在活性GlmU 缺失的mc2155GlmU KOT菌株中,负责合成聚阿拉伯糖末端分支的阿拉伯糖基转移酶(embA)和embB功能可能异常,因而造成mAGP中聚阿拉伯糖末端的改变,故对造成聚糖结构改变的原因继续进行研究、分析,将能更进一步地认识GlmU的功能以及当GlmU功能异常时对细菌造成的影响,这些都将有助于对研究以GlmU为靶点的药物对细菌的影响提供支持.
　　2.2 为提高BCG的免疫活性提供新方向
　　通过BCG接种免疫是预防结核的一个主要的可行性手段.BCG 是减毒活疫苗,可引起淋巴结肿大和化脓等异常反应,在接种BCG的过程中,除了会干扰纯蛋白衍生物(PPD)诊断结核分枝杆菌感染的价值,最主要的禁忌之一就是当接种者有免疫缺陷,特别是细胞免疫缺陷时,不能进行疫苗接种,且BCG的免疫性不能达到完全控制结核的效果.有研究表明,不同地区、不          同年龄的人群接种了BCG后的有效率在0%~80%,因此提高BCG的免疫性成为迫切的需要.
　　分布在分枝杆菌细胞膜上的LAM 被认为主要与细菌导致的免疫应答及毒性的传播等有关.纯化后的甘露糖帽脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)参与了结核分枝杆菌体内感染时抑制某些细胞因子分泌的作用如白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8,使诱发的巨噬细胞凋亡减少并调节树突状细胞的抗原呈递过程,对结核杆菌的毒力和免疫逃避作用可能有大的影响[6].而通过分离纯化得到了BCG细胞壁上的ManLAM,在体外攻击巨噬细胞实验中,发现抑制了巨噬细胞分泌的IL-8和TNF-α.脂甘露聚糖(LM)是LAM 的前体,由embC基因编码的蛋白酶帮助阿拉伯糖链的聚合并转移至甘露糖链上,最终形成脂阿拉伯甘露聚糖.乙胺丁醇(emb)基因簇编码的蛋白酶是一类参与了阿拉伯糖苷的聚合和转移的酶类.通过置换型基因打靶使embC基因功能失活,发现分枝杆  菌胞壁上的LAM 合成停止.而纯化的LM 与LAM 作用相反,在体外攻击巨噬细胞实验中发现诱导了细胞凋亡和IL-12的分泌.IL-12能活化自然杀伤细胞,刺激Thl细胞成熟,形成优势Thl应答.二者都产生了γ-干扰素(IFN-γ),进一步活化巨噬细胞,显著抑制病原菌生长.分析表明,LAM 上的阿拉伯糖链可能掩盖了LM 上甘露糖核心的诱发Thl型细胞因子作用,反而抑制了感染时发生的细胞免疫应答.文献中提到BCG胞壁上的LM/LAM 大约为1.0∶2.5,使BCG的embC基因失活可以使胞壁上LAM 合成停止,改变胞壁上的LM/LAM 的比例后可能会使其免疫活性提高[7].为验证这一推想,采用基因敲除技术构建结核疫苗BCG embC基因缺失株,以便进一步用于细胞实验研究重组卡介苗的免疫活性和功能.
　　首先根据结核分枝杆菌H37RV基因组上embC基因序列设计引物,再在已构建好的重组质粒上插入方向正确的筛选标记片段,通过聚合酶链反应(PCR)鉴定和酶切分析得到重组自杀质粒peeG.将这一质粒通过电穿孔引入生长状态良好的卡介苗中,利用抗性筛选和蔗糖负相筛选得到BCG的embC基因缺失株,并通过PCR鉴定.将重组卡介苗与卡介苗感染Ana-I细胞后,检测不同时间点细胞内一氧化氮(NO)含量[8],发现重组卡介苗比未重组株诱导Ana-I细胞分泌的NO量有较明显增加,提示embC基因在提高卡介苗免疫活性方面有一定影响,这为下一步embC基因功能的研究奠定了基础.
　　2.3 探讨结核分枝杆菌相关的生长基因
　　人类结核病的病原菌结核分枝杆菌系缓慢生长菌,其在人工培养基或感染动物体内生长增殖一代约18~24h.Matsumoto等在体外研究发现分枝杆菌DNA结合蛋白1(MDP1)在卡介苗菌中约占蛋白总量的8%~10%,相对分子质量约为28×103,MDP1蛋白既能抑制基因的转录效率又能在翻译水平干扰蛋白质的合成速度,同时转染MDP1基因至耻垢分枝杆菌和大肠杆菌细胞内均发现,宿主菌的生长速度明显下降.基因敲除技术对载体质粒的基本要求就是能在大肠杆菌中进行复制,但由于缺乏分枝杆菌的复制起点,因此在分枝杆菌中不能自主扩增,同时要携有可供筛选的抗性标志.pKO质粒具有以上这些特征,可用来作为分枝杆菌中基因敲除的良好载体.此研究拟应用基因敲除技术将卡介苗株中的MDP1基因敲除,观察MDP1基因敲除菌株与原代菌株的生长速度.此研究中,MDP1基因敲除菌株的生长速度与原代菌株相比并没有显著的增加[9],分析原因可能有如下:(1)卡介苗菌生长速度的影响因素很多,除了MDP1以外,还有别的因素[10],诸如ITR 操纵子数量的因素;(2)Matsumoto等的研究是体外试验,在体外就去除了很多干扰基因的转录和翻译的因素;(3)结核分枝杆菌是经过长期的进化,参与调节的因素相对复杂.因此,尚不能得出结论认为MDP1是分枝杆菌生长缓慢的主要原因.但本研究通过MDP1基因的敲除,建立了一种分枝杆菌基因的体内研究手段,为以后更多的基因功能的研究提供一种可能的方法.现已证实结核分枝杆菌rmlB和rmlC(结核分枝杆菌的生长相关基因)基因是分枝杆菌生长相关基因[11].
　　2.4 分析结核分枝杆菌相关的毒力基因
　　随着结核杆菌全基因组测序工作的完成,结核杆菌一系列毒力相关基因相继得到克隆与鉴定[12].目前研究发现部分毒力基因,如erp基因、katG基因同时也存在于卡介苗中,在人体免疫功能低下时(如患艾滋病),这些基因的编码产物可能使卡介苗的毒力回复,导致播散性结核病的发生.因此,敲除卡介苗内的这些毒力基因,去除这些毒力基因的潜在威胁,将可能大大提高卡介苗使用的安全性.
　　最近,一组结核杆菌膜蛋白基因引起关注,其中尤以Rv0901基因较为重要.Rv0901在人、牛型毒力结核杆菌广泛存在,而在无毒或减毒株中普遍有缺失、错位和突变现象,其确切功能有待阐明.利用基因敲除技术建立人型结核分枝杆菌标准毒力株HRv37的Rv0901基因缺失的结核杆菌缺陷株模型,并进一步对Rv0901基因缺失株的毒力、Rv0901蛋白表达、Rv0901蛋白功能进行研究.
　　Rv0901基因编码的蛋白是尚未确定其生物特征和功能的假想蛋白,属于结核杆菌特异性蛋白成分,位于结核杆菌胞膜表面,呈表面暴露或属分泌蛋白物质.位于细胞壁和细胞活动基因组及其调节蛋白的下游,受同一操纵子控制,其编码产物是构成结核细胞壁的重要构件[13].初步研究表明,在结核杆菌强毒和无毒株之间,在结核杆菌毒力消减的过程以及人工诱使其突变后,皆可发现毒力结核杆菌的表型变化和致病能力变化.因此在此实验中,自杀载体pRKS10含有用于同源重组的2.4kb的同源DNA序列.在靶片段中没有加入阳性筛选标志,而是在载体上引入了双重筛选标志,从而成功构建了自杀载体pRKS10.目前正利用这个自杀质粒进行结核杆菌HRv37和我国野生毒力株电穿孔转染,进一步的工作正在进行中[14].
　　3 结  语
　　基因敲除技术是否成功有2个重要的影响因素:(1)要求基因同源重组率高,能把真正发生同源重组的胚胎干细胞筛选出来.现在最常用正负筛选法增加重组后阳性克隆的数量.
　　(2)要求弄清种系生长发育过程中的重要基因,非特异性的基因的失活可能破坏重要基因而导致实验动物死亡,因而无法研究基因功能.运用高度精细的重组酶介导2个Loxp位点间的重组(Cre-Loxp)系统,条件性基因敲除技术能在某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因,Cre-Loxp系统为组织特异性基因打靶提供了手段.
　　虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在一定的不足:(1)操作复杂,实验周期长,费用偏高;(2)在敲除过程中,被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区,残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能,这将给表型分析带来麻烦;(3)对于某些必需基因,敲除后会造成细胞死亡,也就无法研究这些必需基因的功能;(4)由于基因功能上的冗余,敲掉一个基因并不能造成容易识别的表型基因家族的其他成员可以提供同样的功能;(5)同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大[15].
　　基因敲除技术是近年来发展起来的新兴分子生物学技术,在特定基因功能的研究中正显示出越来越重要的意义[16-17],可以预见基因敲除技术将会为生命科学领域特别是微生物的研究带来新的突破.